基于多糖和黄酮类成分的铁皮石斛优良内生真菌筛选

[摘要] 为了揭示铁皮石斛内生真菌与功效成分的关系，该研究利用HPLC和紫外分光光度法测定21种铁皮石斛内生真菌菌丝及发酵液提取物中糖类和黄酮类成分。结果表明：21个供试菌株发酵产物乙酸乙酯提取物中均可检测到黄酮类成分，对比色谱保留时间和紫外光谱特征，发现DO49可产柚皮素，DO23，DO81，DO83可产芦丁；21个供试菌株发酵产物水提取物中均检测到多糖，但不同菌株单糖的组成存在差异，参照单糖种类以及甘露糖/葡萄糖的峰面积比，筛选与铁皮石斛多糖相关的优良菌株DO23，DO26，DO81，DO54，DO55，DO83。综合糖类和黄酮类两类成分，筛选出优良菌株DO23，DO81，DO83，既能产生与铁皮石斛相同的黄酮成分，又能产生单糖组分与铁皮石斛相近的多糖。

[关键词] 铁皮石斛； 内生真菌； 单糖组成； 黄酮成分； HPLC

Screening of meaningful endophytic fungi in Dendrobium officinale based on polysaccharides and flavonoids

YU Mengmeng1， WU Lingshang1*， SI Jinping1， LIU Jingjing1， YU Zhixiang1， WANG Huacheng1， ZHANG Min2， RONG Song3

（1Zhejiang Agricultural and Forestry University， Nurturing Station for State Key Laboratory

of Subtropical SilvcultureLin'an 311300， China； 2Huagang Management Office of Landscape

Architecture and Administration of Cultural Heritage of Hangzhou， Hangzhou 310013， China；

3Zhejiang Transfar Agribio Co， Ltd， Hangzhou 310013， China）

[Abstract] To reveal the relationship between endophytic fungi and the functional components， saccharides and flavonoids in the mycelia or fermented liquor of 21 endophytic fungi in Dofficinale were detected using HPLC and UV spectrophotometerThe results showed that the ethyl acetate extracts from 21 fungal strains all contain flavonoidsAccording to the chromatographic retention time of HPLC and UV spectra characteristics of flavonoids， strain DO49 was found produce naringenin， strains DO23， DO81 and DO83 were found produce rutinThe watersoluble extracts from 21 strains all had polysaccharidesHowever， there was difference in the composition of monosaccharides derived from polysaccharides among different strainsAccording to the composition of monosaccharides and the peak area ratio of mannose and glucose， the fungal strains including DO23， DO26， DO81， DO54， DO55， DO83 product polysaccharides associated with Dofficinale were selectedIn conclusion， based on the saccharides and flavonoids， the excellent endophytic fungal strains DO23， DO81 and DO83 were selected， which could produce the same flavonoids and similar polysaccharides in Dofficinale

[Key words] Dendrobium officinale； endophytic fungi； monosaccharide composition； flavonoids ingredients； HPLC

doi：10.4268/cjcmm20161206

药用植物内生真菌因其能产生与宿主相同或相似的生物活性物质，而作为一种新的微生物资源越来越受到关注[1]，先后有报道从红豆杉、喜树、蛇足石杉、贯叶连翘、足叶草、平贝母、杜仲和甘肃棘豆等多种药用植物中分离出能产紫杉醇、喜树碱、石杉碱甲、金丝桃素、鬼臼毒素、西贝母碱、绿原酸和苦马豆碱等的内生真菌[2]。此外，有研究表明内生真菌能产生包括生物碱、黄酮、木脂素、萜类、多糖等多种类型以及新骨架或新结构的化合物，在筛选活性物质方面表现出了巨大潜力[1，3]。

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是我国传统名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎、益智安神、强精壮骨等功效[3]。多糖与黄酮类成分是铁皮石斛主要药效成分[2，47]。目前多糖含量的高低是评价铁皮石斛质量的主要依据。黄酮类物质是一种很强的抗氧剂，可有效清除人体内的自由基，还可以改善血液循环以及降低胆固醇，也可改善心脑血管疾病的症状[8]。铁皮石斛中含有的柚皮素具有显著的抗氧化活性、有高效低毒的抗肿瘤活性、抑制人白血细胞K562细胞增殖作用、抗急性肺损伤等活性[1214]；夏佛塔苷、异夏佛塔苷具有抗氧化、抗肿瘤活性等活性[10]；芹菜素具有雌激素样作用和抗氧化等活性[14]。目前对铁皮石斛内生真菌的研究侧重于内生真菌多样性、菌根真菌功能等方面，铁皮石斛内生真菌的代谢成分研究鲜有报道。本文基于铁皮石斛主要功效成分（糖类及黄酮类成分）筛选铁皮石斛内生真菌优良菌株，为揭示铁皮石斛内生真菌与功效成分的关系，以及铁皮石斛内生真菌的开发利用提供基础。

1 材料与方法

11 供试菌株

供试菌株为课题组前期从活树附生铁皮石斛中分离得到能与铁皮石斛组培苗长期共培养的21株内生真菌（表1）[1517]。

12 仪器与试剂

RE2000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器），SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵，KQ500DE型数控超声波清洗器，ISRSV3恒温振荡器，Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱检测系统。芦丁、芹菜素、夏佛塔苷、异夏佛塔苷等对照品均购自上海源叶生物科技有限公司（批号20120209）；甘露糖、鼠

13 铁皮石斛内生真菌代谢产物粗提

活化菌株，挑取适量菌丝于PDB培养基中，26 ℃，180 r・min-1培养14 d后，菌丝与发酵液混合匀浆，匀浆液用布氏漏斗抽滤，去除菌丝，过滤液等比例加入乙酸乙酯超声萃取30 min，分液漏斗分液，分别得到水部位和乙酸乙酯部位。水部位再加入等比例乙酸乙酯，超声萃取2次，萃取液参照《中国药典》2010年版方法进行多糖粗提[3]。乙酸乙酯部位合并后，50 ℃旋蒸，旋干，加10 mL甲醇溶解。将不接菌的PDB培养基按上述方法提取，作为空白对照。

14 黄酮类成分的测定

141 总黄酮含量测定 以芦丁为对照品，采用NaNO2Al（NO3）3NaOH显色，在510 nm波长处用紫外分光光度法测定，本试验标准曲线方程为Y=12016X-0010 7，R2=0999 9，X为芦丁质量浓度（g・L-1），Y为吸光度，重复3次。

142 黄酮类成分HPLC测定 取13方法得到的乙酸乙酯提取溶液2 mL，045 μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱条件：UI timate XBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；柱温 300 ℃；流动相水（B）乙腈（D）；梯度洗脱，0～17 min，95%B；18～27 min，83%B；28～87 min，83%～50%B；88～97 min，50%～40%B；98～108 min，40%～0 B；108～118 min，0 B；118～119 min，0～95%B；119～128 min，95%B；流速100 mL・min-1；进样量 400 μL；检测波长335 nm。

15 水部位提取物中单糖组成的测定

按13方法得到的水部位多糖粗提物进行单糖衍生[3]，按下述液相色谱条件进行测定：UItimate XBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相：002 mol・L-1的乙酸铵水溶液（B）乙腈（D）；梯度洗脱，0～59 min，82%B；60～62 min，82%～79%B；63～77 min，79%B；78～82 min，82%B；流速10 mL・min-1；进样体积80 μL；检测波长250 nm。

16 数据统计与分析

利用Excel 2007对铁皮石斛内生真菌各种单糖峰面积数据进行整理，利用SPSS 170软件对不同样品总黄酮含量进行单因素方差分析与多重比较，中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件用于比较各菌株代谢产物提取物与黄酮类成分对照品以及铁皮石斛组培苗黄酮类成分HPLC图谱保留时间。

2 结果与分析

21 基于黄酮类成分的铁皮石斛内生真菌筛选

211 不同菌株黄酮类成分比较 通过铁皮石斛内生真菌乙酸乙酯提取物与5个黄酮类成分对照品及铁皮石斛组培苗中黄酮类成分HPLC保留时间比较分析，发现21个菌株均具有与对照品或植物黄酮类成分保留时间相近的峰（±015 min，图1）。其中，组培苗HPLC图谱中有7个峰在270，335 nm处表现出黄酮类成分紫外吸收光谱特征。经HPLC保留时间比对结合紫外特征光谱，确定菌株DO23，DO81，DO83可产芦丁成分，DO49可产柚皮素。

212 不同菌株总黄酮含量比较 通过紫外光谱分析，发现21个菌株乙酸乙酯提取物中均能检测到黄酮类成分，不同菌株总黄酮含量存在显著差异（表2），其中以菌株DO34的总黄酮含量最多，质量浓度达到510 g・L-1， DO49次之，为443 g・L-1，而DO40最少，为045 g・L-1。

22 基于糖类成分的铁皮石斛内生真菌筛选

21种铁皮石斛内生真菌水部位提取物中检测到7种单糖对照品成分，其中仅甘露糖、葡萄糖、半乳糖为21个菌株的共有组分，不同的菌株单糖的1～5分别为对照品夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芦丁、芹菜素、柚皮素；6～11未知黄酮类成分。

组成存在差异。按单糖成分种类，可将铁皮石斛内生真菌划分为5类（图2）：第Ⅰ类菌株仅产生甘露糖，葡萄糖以及半乳糖3种单糖，有DO47，DO26，DO23，DO49，DO22，DO18，DO65，DO77，DO82，DO85菌株；第Ⅱ类菌株特有单糖成分为鼠李糖，有DO78，DO81，DO54，DO124，DO34，DO84，DO31菌株；第Ⅲ类菌株能产生阿拉伯糖和3种共有单糖，有DO81，DO40菌株；第Ⅳ类菌株特有单糖为木糖，只包含DO55菌株；第Ⅴ类菌株单糖种类最丰富，可产生甘露糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖6种单糖组分，有DO83菌株。

同时，不同铁皮石斛内生真菌单糖相对峰面积比也存在差异（表3），其中DO81，DO54，DO23，DO26样品的甘露糖与葡萄糖相对峰面积比在3758～6847，与铁皮石斛甘露糖/葡萄糖的峰面积比相近。参照单糖种类以及甘露糖与葡萄糖的峰面积比，筛选菌株DO23，DO26，DO81，DO54，DO55，DO83作为与铁皮石斛多糖相关的优良菌株。

CK不接菌的PDB培养基水部位提取物；1～7号峰分别为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖；单糖成分种类，可将铁皮石斛内生真菌划分为5类，第Ⅰ类菌株包含甘露糖、葡萄糖、半乳糖3种单糖， 第Ⅱ类菌株含甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖4种单糖， 第Ⅲ类菌株包含甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖4种单糖， 第Ⅳ类菌株包含甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖4种单糖， 第Ⅴ类菌株包含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖。

3 结论与讨论

研究结果表明，21个供试菌株发酵产物中均能检测到黄酮类成分，其中菌株DO23，DO81，DO83可产芦丁，DO49可产柚皮素。在与铁皮石斛植物样品HPLC图谱比较中，发现部分菌株还能检测到除标样外其他与铁皮石斛成分保留时间相同的色谱峰，且紫外吸收光谱表现出黄酮类成分的特征，表明这些菌株能产生其他黄酮成分。21个供试菌株均能产生多糖类成分，但不同的菌株单糖的组成存在差异，表明不同的内生真菌产生的多糖也不同。铁皮石斛多糖部位水解后可同时得到多种单糖成分，其中甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖醛酸为石斛多糖的特征峰[1819]，鼠李糖在铁皮石斛中鲜有发现。菌株DO83代谢产物中均含有6种单糖，接近铁皮石斛的单糖组成。此外，菌株DO23，DO26，DO81，DO54与铁皮石斛甘露糖/葡萄糖的峰面积比相近。结合前期活树附生铁皮石斛内生真菌多样性研究，发现本研究中能产黄酮或多糖的菌株多数为铁皮石斛优势种，而其他多为分离频率较低的菌株[20]，表明优势种在产宿主相似的活性成分方面有巨大的潜力。

基于黄酮类及糖类成分，筛选出优良菌株DO23，DO81，DO83，能产生与铁皮石斛相同的黄酮成分，且产生的单糖组分与铁皮石斛较为接近，有可能成为铁皮石斛替代物的重要资源。鉴于黄酮与多糖为2类活差别较大的成分，筛选出的仅产多糖或黄酮成分的菌株对阐述内生真菌与铁皮石斛功效成分的关系时具有重要意义。优良菌株的筛选将为今后内生真菌的功能开发及利用研究提供基础，同时为内生真菌与宿主间关系研究提供了优良素材。

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