基于分子模拟技术筛选LXRβ中药激动剂

[摘要] 肝X受体β（liver X receptor β，LXRβ）与体内胆固醇代谢密切相关，是治疗高脂血症的药物新靶点。该文以LXRβ激动剂为载体，利用3DQSAR pharmacophore（Hypogen）模块构建定量药效团，得到最优的药效团模型包含1个氢键受体，1个芳环基团和2个疏水基团，药效团的5项评价指标分别为：训练集化合物的预测活性值和实验活性值的相关系数（correlation）为0.95、模型的费用函数（Δcost值）为128.65、活性化合物有效命中率（HRA）为84.44%、辨识有效性指数（IEI）为2.58、综合评价指数（CAI）为2.18。利用最优药效团模型筛选中药化学成分数据库（traditional Chinese medicine database，TCMD），初步获得309个潜在的中药活性成分。随后利用Libdock分子对接方法进一步精制筛选结果，基于原配体的打分值以及关键氨基酸建立筛选规则，最终得到去甲氧基姜黄素、异甘草黄酮醇、胀果甘草查尔酮E、水飞蓟宁4个化合物为潜在的LXRβ激动剂。该研究可以高效、低耗的筛选潜在的LXRβ中药激动剂，为抗高血脂新药研发提供助力。

[关键词] LXRβ激动剂； 药效团； 虚拟筛选； 分子对接； 中药

高脂血症是一种或几种脂质由于脂质代谢紊乱引起脂质水平异常的一种病症，是引起心脑血管疾病的一个主要因素。脂质代谢紊乱表现在甘油三酯过度合成、胆固醇代谢平衡失调等方面[1]。近年来研究发现，肝X受体β（liver X receptor β，LXRβ）与胆固醇代谢平衡过程密切相关[24]。LXRβ是核受体家族成员LXRs的一种亚型，在全身各组织中均有表达。LXRs激动剂可以上调甾醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1C）的表达，导致血浆中甘油三酯水平的升高和肝脏中脂肪的堆积，而选择性的激活LXRβ，诱导ATP结合盒转运蛋白A1（ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1）的表达，可以升高血浆中高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平，从而增加胆固醇的逆向运转[5]，而不会导致肝脏内脂肪的堆积。因此，LXRβ已成为一个治疗高脂血症的药物新靶点[6]。

分子模拟技术由于高效、低耗等优点，已经被广泛用于新颖化合物的筛选和分子机制的研究。例如：Rella M等利用药效团和分子对接技术筛选得到血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）抑制剂[7]，宋向岗等利用分子对接技术探讨了川芎治疗脑缺血的物质基础及分子作用机制[8]。中药具有低副作用和高活性的特征，在治疗复杂疾病方面取得了很大的成就。例如：罗千古论述了中药从抑制脂类吸收、影响胆汁酸循环、抗过氧化、提高HDL、降低低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）等方面的作用来达到降血脂的目的[9]。因此，利用分子模拟技术从中药中发现潜在活性成分具有广阔的应用前景。

本研究首先利用已知的LXRβ激动剂构建Hypogen定量药效团模型，利用最优药效团模型筛选中药化学成分数据库（traditional Chinese medicine database，TCMD），将获得的与药效团完全匹配并具有类药性质的化合物利用分子对接技术进一步筛选，通过分析配体受体相互作用模式，最终获得4个潜在LXRβ激动剂。该研究表明利用分子模拟技术筛选潜在的中药活性成分具有一定的可行性和高效性，也为基于LXRβ激动活性的抗高血脂药物研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 LXRβ药效团的研究

1.1.1 数据来源及准备 以“LXRβ”为关键词在The Binding Database（http：///）中搜索对人源LXRβ具有激动活性的化合物61个，优选16个化合物作为训练集，其活性值EC50的范围是4～2 200 nmol・L-1，化合物的化学结构、ID号和EC50见图1。余下的45个活性化合物与来源于同一数据库的135个非活性化合物组成测试集。利用Discovery Studio 4.0（DS4.0）对训练集化合物进行构象分析，采用BEST方法，能量阈值为20 Kcal・mol-1，最大构象数目为255个。随后进行训练集化合物的药效团特征识别，训练集化合物药效特征主要包含：氢键受体（hydrogen bond acceptor，A）、脂性氢键受体（hydrogen bond acceptor lipid，Ali）、氢键供体（hydrogen bond donor，D）、疏水基团（hydrophobic region，H）、正离子基团（positive ionizable，PI）、芳环基团（ring aromatic，R）。

1.1.2 HypoGen药效团模型的构建 采用3DQSAR pharmacophore（Hypogen）模块构建LXRβ激动剂定量药效团模型[10]。根据药效团特征识别结果，选择A，D，H，R，PI共5类特征进行组合，排除体积（maximum excluded volumes，EV）个数限制设为5，活性不确定度（activity uncertain）为1.5，其他参数值均为默认值。

1.1.3 HypoGen药效团模型的验证与评价 利用测试集对构建的模型进行验证，根据5个评价指标选择最优的药效团模型，分别是训练集化合物的预测活性值和实验活性值的相关系数（correlation）、模型的费用函数（Δcost值）、活性化合物有效命中率（HRA）、辨识有效性指数（IEI）、综合评价指数（CAI）[11]。correlation值表示训练集化合物实验活性值和预测活性值之间的相关系数，该值越大，说明模型的预测准确性越高；Δcost是指NullCost与TotalCost的差值，该差值大于60，说明模型有90%以上的真实性，差值在40～60，说明有75%～90%的可能反映了真实情况，差值小于40，说明模型的真实性小于50%[11]；NullCost表示没有药效特征的药效团的费用值；HRA表示模型匹配测试集活性化合物的有效命中率；IEI表示辨识有效性参数；CAI表示综合评价指标。

1.2 TCMD数据库的筛选

采用最优HypoGen药效团模型筛选包含23 033个化合物的TCMD 数据库[12]，搜索模式为Best Search，匹配模式为柔性匹配，其他为默认参数。利用类药五规则对药效团模型命中的化合物进行类药性质评价[13]。选择具有类药性质、与最优药效团完全匹配且匹配值大于训练集化合物最低匹配值的化合物用于进一步的分子对接研究。

1.3 LXRβ的分子对接研究

LXRβ的蛋白三维结构从PDB数据库（http：//）中获得，优先选择复合激动活性配体且分辨率较高的晶体结构，确定PDB：1PQC、复合激动剂T0901317的蛋白复合物作为研究载体。随后对蛋白结构进行预处理：补全不完整残基、删去配体分子和水分子、加氢和分配相关电荷、删除多余蛋白质构象等[14]。处理后的蛋白进行分子对接研究。

基于晶体结构中复合的原配体初步定义活性口袋。采用半柔性且快速的LibDock方法进行分子对接研究。将原配体取出后重新对接进入活性口袋，对接后配体产生的构象与晶体结构复合的原配体分子构象进行比较，计算均方根偏差（rootmeansquare deviation，RMSD），当RMSD≤2.0 时，表明选择的对接方法以及对接程序的参数设置能较好的重现原配体受体的结合模式[15]。本文通过调整活性口袋半径的大小以及坐标位置使RMSD值达到要求，记录此时活性口袋的信息以及原配体的打分值，并设置原配体打分值的80%为阈值，打分值高于阈值且相互作用模式与原配体相似的化合物为潜在的活性化合物[16]。

2 结果与讨论

2.1 LXRβ HypoGen药效团模型的构建与验证

构建得到10个HypoGen药效团模型，其NullCost值均为208.35，与TotalCost的差值Δcost均大于90，表明所构建的药效团模型具有可靠性。其中Hypo1模型的correlation值为95%，表明模型对训练集化合物的预测值和实验值具有高度的一致性，其预测结果见表1。基于EC50值，16个训练集化合物被分为4类：分别是EC50

利用测试集对构建的10个模型进行验证与评价，结果见表2。由表2可知，Hypo1，Hypo2可以命

中38个活性化合物，Hypo9可以命中37个活性化合物，这3个模型的活性化合物有效命中率均大于80%，且3个模型的IEI和CAI值都大于2，而Hypo1的correlation值和Δcost值最大，表明模型预测准确性较高，因此确认其为最优的药效团模型，该模型包括1个A、1个R、2个H，见图2。最优药效团模型与原配体的匹配值为10.32，预测EC50为29.97 nmol・L-1，该预测值与实验的活性值相近，其结果也说明了模型的准确性，其匹配图见图3。

2.2 TCMD数据库筛选

利用最优药效团模型Hypo1筛选TCMD，共获得5 144个化合物，再经类药五原则筛选，得到2 386个具有类药性质的化合物。基于匹配值大于8.60的筛选标准，得到309个化合物作为潜在活性化合物，其中2个预测活性较高的化合物：六氢姜黄素和异鼠李素，已有文献报道具有明确的抗高血脂作用[1718]，表明模型具有一定的准确性，其与药效团匹配情况见图4。

2.3 分子对接

本文基于原配体定义活性口袋，口袋半径为9.00 ，空间坐标位置为-11.54，35.33，40.27，原配体对接RMSD值为1.80，打分值为136.50。分析原配体与受体的相互作用模式，发现原配体与氨基酸残基HIS435，THR272，ALA275形成氢键作用，与TRP457，PHE329，LEU274，MET312形成疏水作用。

原配体与受体的相互作用见图5。据文献报道氨基酸HIS435是激动剂与受体结合的关键氨基酸[19]。结合原配体的打分值与相互作用模式建立潜在活性化合物筛选规则：化合物打分值高于阈值（109.2），且分子对接过程中必须与氨基酸残基HIS435形成氢键相互作用。

与氨基酸HIS435，THR272，PHE268发生氢键相互作用，与氨基酸LEU274，MET312，PHE329，ALA275，PHE340，PHE271，TYR335形成疏水相互作用，见图8；胀果甘草查尔酮E与氨基酸HIS435，THR272，PHE268，THR316发生氢键相互作用，与LEU274，PHE329，LEU345，PHE340，PHE271，TYR335形成疏水相互作用，见图9；水飞蓟宁与氨基酸HIS435，THR272，PHE268，TRP457，TYR335发生氢键相互作用，与氨基酸MET312，PHE329，ALA275，PHE271，LEU345形成疏水相互作用，见图10。4个潜在活性化合物与受体结合的相互作用模式与原配体的作用模式相似，且都与氨基酸HIS435发生氢键相互作用[19]，推测应表现相似的生物活性。另外，去甲氧基姜黄素的来源中药是姜黄[17]，异甘草黄酮醇的来源中药是甘草[20]，这2味中药已有明确报道证明其具有抗高血脂作用，进一步表明实验结果具有一定的可靠性。

3 结论

LXRβ是核受体家族成员LXRs的一种亚型，通过配体激活后调控下游的靶基因从而发挥调节脂质代谢的作用。本文基于16个LXRβ激动剂构建定量药效团模型，经过对训练集化合物的活性预测和测试集化合物对模型的验证和优劣评价，综合考虑5个评价指标得到最优药效团模型。采用最优药效团模型对TCMD进行搜索，按照类药五规则对药物进行筛选，保留通过类药性评价和匹配值大于8.60的化合物，将所得的结果用于分子对接研究，精制筛选结果，其中2个高打分的化合物已有文献验证其具有抗高血脂活性。最后，综合考虑匹配值、预测活性值、分子对接打分值和相互作用等因素，去甲氧基姜黄素、异甘草黄酮醇、胀果甘草查尔酮E、水飞蓟宁等4个化合物被确定为潜在的LXRβ激动剂，可以作为抗高血脂新药研发的先导化合物。

去甲氧基姜黄素来源于中药姜黄，是姜黄发挥药理作用的重要成分，且有研究表明姜黄的降脂作用机制有减少外源性脂质的吸收，减少内源性脂质的合成，促进脂质转运和排泄，调节脂质代谢等作用[17]，因此，去甲氧基姜黄素可能通过作用LXRβ靶点，调节脂质代谢产生降血脂作用。异甘草黄酮醇和胀果甘草查尔酮E属于黄酮类化合物，同时，大量的研究表明黄酮类化合物具有抑制脂质合成、吸收、氧化，促进脂质代谢、转运等作用[21]。本研究后期将会结合分子动力学和生物验证对这4个潜在的活性化合物进行验证，最终确定化合物的活性。

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