HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

【摘要】 目的 构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。方法 选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。结果 酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。结论 成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。

【关键词】 HIF-1α,RNAi,慢病毒

Construction and Identification of HIF-1αRNAi Lentiviral Vector

SHEN Shang-hang, WANG Zhan-xiang, CHEN Yu-ying,et al.

Department of Neurosurgery, First Hospital of Xiamen Affiliated to the Fujian Medical University, Xiamen 361003,China

【Abstract】 Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral

基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);

厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)

作者单位:361003 厦门,福建医科大学附属厦门第一医院

vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.

【Key words】 HIF-1α;RNAi;Lentivirus

缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。很多肿瘤存在HIF-lα的高表达,并与肿瘤的侵袭转移,耐药等相关[2]。已有研究表明 HIF-1α参与了 VEGF、SDF21 的表达调控,同时,它还直接或者间接地参与了血管新生、基质缺氧微环境的发生以及细胞增殖与凋亡的调节过程。Gillespie 等[3]在神经胶质瘤U251细胞株上 shRNA 稳定转染取得显著效果。可见,如人为干预HIF-1α的功能将有望控制肿瘤细胞的增殖。本研究选择慢病毒lentilox3.7表达系统,采用基因直接克隆连接的方法, 构建表达HIF-1α shRNA的慢病毒载体。

1 材料与方法

1.1 材料 293T细胞、慢病毒表达载体plentilox3.7、E.coli DH5α均由厦门大学生命科学学院实验室保存;T4 DNA 连接酶、限制性内切酶购自Promega公司;DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司,质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒为Tiangen公司产品。慢病毒包装系统由plentilox3.7、PHR、VSVG质粒组成。

1.2 方法

1.2.1 shRNA慢病毒载体构建 确定用于载体构建的干扰HIF-1α基因表达的引物,正义链:

5’-tGATCCAGAGTCACTGGAACTTtcaagagAAGTTCCAGTGA

CTCTGGATCttttttc-3’;

反义链:

5’-tcgagaaaaaaGATCCAGAGTCACTGGAACTT

ctcttgaAAGTTCCAGTGACTCTGGATCa-3’;

(内含XbaⅠ和XhoⅠ酶切位点),由Invitrogen公司合成。引物退火形成双链DNA,与XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pll3.7)连接,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞,使用Tiangen公司质粒提取试剂盒提取质粒,经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切电泳鉴定。

1.2.2 慢病毒包装 采用磷酸钙转染法,具体为:转染前一天将293T细胞铺于100 mm dish,当第二天细胞密度达到80%左右即可进行转染。在转染前提前2 h对293T细胞换液,不用PBS洗,加入5 ml预热的DMEM。按下列量比配置转染试剂体系:A:plasmid (pLL3.7 20 ug; PHR 15ug; VSVG 6ug) 2.5M CaCl2 50ul补充水至500 ul,混匀。在加入2XHBS前,用移液器把A液混匀。把2 ml EP管放在涡旋振荡器上,一边震荡一边逐滴加入500ul的2XHBS。震荡时要保证EP管底一直接触在振荡器上,如果有弹起,则会使管内液体溅出。加完2XHBS后,盖紧盖子,在涡旋震荡1 min。室温下放置5 min,逐滴加入培养皿中,一边滴加一边混匀。培养箱内培养6~8 h。更换新的D2(即含2%血清的DMEM)培养基10~15 ml,继续培养至48~54 h(从转染时开始计算时间)。收集的细胞上清,先经离心6000 g,5 min,去除大的细胞碎片,再经过0.45 um一次性滤器过滤。将35 ml 过滤的上清加入到一个50 ml的高速离心管中,平衡。4度,75 000 g,2 h高速离心。以10 μl每管分装病毒液置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 慢病毒滴度测定 将制备好的病毒颗粒按一定比例稀释后,再分别感染293T细胞,用流式细胞仪测病毒滴度。

测序图谱

1 CAAACTAAAG ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT TATTACAGGG

GTTTGATTTC TAATGTTTTT GTTTAATGTT TTTAAGTTTT AAAAGCCCAA ATAATGTCCC

61 ACAGCAGAGA TCCAGTTTGG TTAGTACCGG GCCCGCTCTA GAGATCCGAC GCGCCATCTC

TGTCGTCTCT AGGTCAAACC AATCATGGCC CGGGCGAGAT CTCTAGGCTG CGCGGTAGAG

121TAGGCCCGCG CCGGCCCCCT CGCACAGACT TGTGGGAGAA GCTCGGCTAC TCCCCTGCCC

ATCCGGGCGC GGCCGGGGGA GCGTGTCTGA ACACCCTCTT CGAGCCGATG AGGGGACGGG

181 CGGTTAATTT GCATATAATA TTTCCTAGTA ACTATAGAGG CTTAATGTGC GATAAAAGAC

GCCAATTAAA CGTATATTAT AAAGGATCAT TGATATCTCC GAATTACACG CTATTTTCTG

241 AGATAATCTG TTCTTTTTAA TACTAGCTAC ATTTTACATG ATAGGCTTGG ATTTCTATAA

TCTATTAGAC AAGAAAAATT ATGATCGATG TAAAATGTAC TATCCGAACC TAAAGATATT

301 GAGATACAAA TACTAAATTA TTATTTTAAA AAACAGCACA AAAGGAAACT CACCCTAACT

CTCTATGTTT ATGATTTAAT AATAAAATTT TTTGTCGTGT TTTCCTTTGA GTGGGATTGA

361 GTAAAGTAAT TGTGTGTTTT GAGACTATAA ATATCCCTTG GAGAAAAGCC TTGTTTGATC

CATTTCATTA ACACACAAAA CTCTGATATT TATAGGGAAC CTCTTTTCGG AACAAACTAG

421CAGAGTCACT GGAACTTTCA AGAGAAGTTC CAGTGACTCT GGATCTTTTT TCTCGAGGTC

GTCTCAGTGA CCTTGAAAGT TCTCTTCAAG GTCACTGAGA CCTAGAAAAA AGAGCTCCAG

注:黑体部分为干扰HIF-1α基因表达的序列的正、反义链

2 结果

2.1 pLL3.7 HIF-1α的双酶切鉴定 将连接产物转化大肠埃希杆菌E.coli DH5α后,利用含氨苄青霉素的LB固体培养基平板筛选阳性克隆质粒。挑取单菌落结种LB液体培养基,使用Tiangen公司质粒提取试剂盒提取菌落质粒,经XbaⅠ和NotⅠ酶切电泳鉴定。HIF-1α基因干扰的重组质粒经双酶切得产物为506bp (插入片段为57bp),与双酶切后没有插入片段的pLL3.7空载体产物449bp为对照,发现2、3产物鉴定结果和预期一致(图1),即阳性菌落质粒。取一定剂量的阳性菌落质粒送南京金斯特公司测序证实所含目的基因序列准确无误(见测序图谱)。结果表明HIF-1α shRNA成功构建于pLL3.7载体上,重组体构建成功。

图1 pLL3.7 neo HIF-1α重组质粒酶切鉴定

M: 100bp DNA Marker;4,5:pLL3.7 Empty vector;1,2,3 Positive recombinant pLL3.7 neo HIF-1α

2.2 慢病毒包装及滴度测定 图2a、2b分别为包装293T细胞24 h、48 h荧光显微镜下所见,将包装293T细胞后收集到的病毒上清再次转染293T细胞, 在流式细胞仪下计数GFP的表达量, 病毒滴度为表达GFP的细胞数×相应稀释倍数, 测定滴度为2×108pfu/ml。

图2 转染293T细胞24 h、48 h荧光显微镜下(×100)

3 讨论

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,占40%~50%。由于其浸润性生长,手术难以彻底切除,术后常辅以化疗和放疗,但总体效果不佳。HIF-1作为低氧适应反应的关键调节因子,与肿瘤的生长和侵袭性切相关,在肿瘤的发生发展中起关键作用。HIF-1由α和β两个亚基组成 ,α亚基既是 HIF-1的功能性亚基 ,又是其调节亚基 ,决定 HIF-1的生物学活性。研究显示,HIF-1与肿瘤行为有诸多相关性:①在恶性肿瘤内,很易观察到HIF-1的高表达,且与肿瘤的恶性程度一致;②体外实验发现HIF-1调控很多肿瘤相关因子的表达。Fujiwara 等[4]研究发现针对HIF-1α的 siRNA 能通过下调 MMP2 和上调 TIMP2 的 mRNA,抑制MMP2 和 MMP9 的酶活性,进而明显的抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭;③人为干预造成HIF-1失活,对肿瘤的生长有影响。因此,如人为干预HIF-1α的表达,有望为胶质瘤的治疗提供一条新的途径。

HIF-1α主要通过两条信号途径起作用:①PI-3K/Akt依赖的HIF-1α蛋白稳定性调控;在乏氧条件下,活化的PI-3K具有脂激酶活性,是胞内重要的PtdIns信号调节分子,并且具有蛋白激酶活性,可激活MAPK途径, 从而使PI-3K 作用于膜上磷脂, 产生第二信使,进而激活下游蛋白丝/苏氨酸激酶,包括PKB/Akt、p70S6K、PKC及PKC 相关激酶,导致HIF-1αmRNA的增加;②MEK/MAPK介导的HIF-1α反式激活功能调控:此路径并不是必须在低氧条件下进行的,而是与细胞类型相关。如在成纤维细胞MAPK的活性可被MEK的抑制剂PD098059所阻断而低氧诱导的HIF-1α活性不受影响,相反在HT42和Rat-1成纤维细胞用同样抑制剂PD098059处理,在常氧和低氧条件下HIF-1α转录活性均有中等程度的下降。

RNAi具有以下4个特征[5]: RNAi 属于转录后水平的基因沉默机制(PTGS) ,对 DNA 序列的复制和转录过程不产生影响; RNAi具有高度的特异性,如果有1个碱基与靶序列错配,其干扰效应将大大减弱; RNAi 具有高效性,远远少于内源 mRNA 数量的 dsRNA 就能引起该基因缺失的表型;RNAi 的效应可在不同细胞中传递甚至在某些生物中可遗传作为基因抑制的一种有力工具,与其他的方法相比, RNAi 具有操作简单 成功率高 特异性高和高效性。有研究者认为以载体为基础的shRNA表达系统在诱导基因沉默方面比siRNA更有效率[6]。

慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,逐渐成为理想的基因转移载体。目前慢病毒载体已经发展到第三代,其突出特点是:其一构建了自身失活(SN)的慢病毒载体,即删除了U3 区的3’LTR , 在逆转录过程中存在于病毒基因组3’端U3 区的启动子/ 增强子元件将被复制, 并置于前病毒两端的LTR。因此, 3’LTR 的U3区启动子发生失活突变后, 将在逆转录过程中转移至5’LTR ,使载体失去HIV-I增强子及启动子序列, 即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。其二是去除了tat基因代之以异源启动子序列, 进一步减少了复制型慢病毒的产生,但并不明显慢病毒,这样原始的HIV基因组中的9个基因在构建的HIV慢病毒载体中只保留了3 个(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒载体系统更加安全[7]。

本实验成功构建出了HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α,为下一步研究沉默其表达对人胶质瘤细胞生长和侵袭性的影响奠定了基础。

参 考 文 献

[1] Adams JM, Difazio LT, Rolandelli RH, et al. HIF-1: a key mediator in hypoxia. Acta Physiol Hung, 2009, 96(1): 19-28.

[2] Sun HC, Qiu ZJ, Liu J, et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis. Int J Oncol, 2007, 30(6): 1359-1367.

[3] Gillespie DL, Whang K, Ragel BT, et al. Silencing of hypoxia in-ducible factor-1alpha by RNA interference attenuates human glioma cell growth in vivo. Clin Cancer Res, 2007, 13(8): 2441-8.

[4] Fujiwara S, Nakagawa K, Harada H, et al. Silencing hypoxia-inducible factor-1alpha inhibits cell migration and invasion under hypoxic envi-ronment in m alignant gliomas. Int J Oncol, 2007, 30(4): 793-802.

[5] 刘俊,常炜.RNAi技术沉默HIF-1α基因表达的研究进展. 现代生物医学进展,2009,9(13):2586-2589.

[6] Cheng TL,Chang WT.Construction of simple and efficient DNA vector-based short hairpin RNA expression systems for specific gene silencing in mammalian cells.Methods MolBiol, 2007,408:223-241.

[7] Ramezani A, Hawley RG.Overview of the HIV-I lentiviral vector system.CurrProtoc Mol Biol, 2002,16 (21):1-15.