缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子在腺样囊性癌中的表达和相关性研究

【摘要】 目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)在腺样囊性癌(ACC)中的表达和相关性,并探讨它们在腺样囊性癌侵袭和转移生物学行为的机理。方法 应用免疫组化SP法,检测35例腺样囊性癌、13例多形性腺瘤和10例正常唾液腺组织中HIF-1α、VEGF的表达和MVD计数。 结果 HIF-1α、VEGF、MVD计数在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、ACC中依次增加,组间差异具有统计学意义(P

【关键词】 缺氧诱导因子-1α;微血管密度;腺样囊性癌;血管内皮生长因子

Expression and correlative investigation of hypoxia inducible fector-1αand vasculare endothelialgrowth factor in salivary adenoid cystic carcinoma

YOU Yun-hua,LIANG Jun , HUANG Zhi- quan,et al.

Department ofOralandMaxillofacial Surgery,TheFifthAffiliatedHospital, Sun Yet-sen University, Zhuhai,Guangdong 519000,China

【Abstract】 Objective To investigate the expression of hypoxia inducible fector-1α(HIF-1α)、vasculare endothelialgrowth factor (VEGF)、microvessel density(MVD) and their relations in adenoid cystic carcinoma (ACC),and explore the invasion andmetastasis biological behaviour by HIF-1α,VEGF ,MVDin ACC. Methods SP immunochemistry was applied to detect the expression of HIF-1α、VEGF、MVD counted number in 35 cases of ACC,13 cases of pleomorphic adenoma,10 cases of normal salivary gland tissue. Results Positive expression rate of HIF-1α,VEGF ,MVD enhanced in normal salivary gland tissue, pleomorphic adenoma and ACC stepply(P

【Key words】 Hypoxia inducible fector-1α; Microvessel density; Adenoid cystic carcinoma;Vasculare endothelialgrowthfactor

基金项目:珠海市科技计划基金项目资助(项目编号:PC20071003)

作者单位:519000 中山大学附属第五医院口腔颌面外科(游云华 梁军 汪跃平 张华伟);中山大学附属第二医院口腔颌面外科(黄志权);广州医学院口腔医院口腔颌面外科(欧阳可雄)

腺样囊性癌( Adenoid cystic carcinoma,ACC)在唾液腺恶性肿瘤中常见,具有沿血管神经侵犯和易于远处转移等特殊的生物学行为[1]。肿瘤的形成和生长与血管形成密切相关,肿瘤的快速生长和肿瘤内部血液供应的相对不足是肿瘤生长过程中的必然现象,供血不足导致实体肿瘤内部形成缺氧微环境使肿瘤细胞的许多生物学行为朝恶性方向转化,如促血管生成能力提高、转移能力增强、癌基因在分子水平上选择性表达,从而使肿瘤的快速生长与缺血缺氧处于对立统一状态,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-Inducible Fator 1 alpha, HIF-1α)调节肿瘤血管生成机制是目前肿瘤研究的热点之一, 其具有较强的促血管生成作用,其中血管内皮生长因子(vasculare endothelialgrowth factor,VEGF)发挥关键作用[2] 。本研究应用免疫组织化学法检测HIF-1α、VEGF和CD34标记微血管密度(microvesse density,MVD),以期探讨HIF-1α、VEGF和MVD计数在ACC中的表达和相关性,并探讨它们在ACC侵袭和转移生物学行为的作用机理。

1 材料和方法

1.1 回顾分析 课题组收集2002年6月至2008年6月口腔颌面外科切除的35例病理科保存确诊为ACC的石蜡包埋标本为实验组;此外,以同期手术切除的13例多形性腺瘤(pleomorphic adenoma,PA)和10例需手术切除的正常唾液腺组织石蜡包埋标本作为对照组。记录患者的临床资料,其中男20例、女15例,年龄25～59岁,平均35.4岁。部位:腮腺21例,颌下腺8例,舌下腺6例。所有病例均为首发,术前均未行放射治疗和化学治疗及其他相关的抗肿瘤治疗。

1.2 主要试剂 CD34(QBEnd/10)、HIF-1α(H1α67)、VEGF(VG1)单克隆抗体,和SP试剂盒均为美国Neomarker产品,购自福建迈新公司,其中SP试剂盒为即用型,其余浓缩型抗体稀释度均为1:50,均采用微波抗原修复,VEGF使用EDTA缓冲液,其余均使用枸橼缓冲液。

1.3 方法 HIF-1α、VEGF和CD34的检测采用SP免疫组化法,染色程序按S-P试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性表达组织(乳腺癌)作阳性对照。

1.4结果判断

1.4.1HIF-1α、VEGF着色所有阳性表达均为棕黄色,定位于细胞浆或细胞核,以阳性细胞数量作为观察指标,至少观察10个高倍视野中阳性肿瘤细胞数占所观察肿瘤细胞总数的百分比,50%记为“++”[3]。

1.4.2 MVD的测定 根据Weidner[4]法进行MVD计数:先在低倍镜下扫视整个切片区寻找微血管高密度区即热点,然后在200倍光镜下计数被染成棕色的血管内皮细胞簇,结果用3个200倍视野下血管数目的平均数来表示。

表1

HIF-1α蛋白在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中的表达

分组例数

HIF-1α表达

-+++

正常唾液腺组织1010(100.00%)0(0.00%)0(0.00%)

多形性腺瘤1311(84.70%)2(15.30%)0(7.65%)

腺样囊性癌3510(28.60%)15(42.80%)10(28.60%)

注:r=0.611,P

1.5 统计学方法

计数资料采用χ2检验或精确概率法比较两组或多组之间阳性率的差别。计量资料分别采用t检验和单因素方差分析进行两组与多组之间样本均数的比较。P

2 结果

2.1 HIF-1α在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中的表达(见表1)。

图1 腺样囊性癌HIF-1α免疫组化染色200×

2.2 CD34在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中的表达(见表2)。

表2

MVD在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中表达的差异

分组例数MVD(x±s)F(P)

正常唾液腺组织1016.20±3.54

多形性腺瘤1325.32±4.30

腺样囊性癌3545.80±4.2310.23(

图2 腺样囊性癌CD34免疫组化染色200×

2.3 VEGF在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中的表达(见表3)。

图3 腺样囊性癌VEGF免疫组化染色200×

2.4 CD34在腺样囊性癌中表达及其与HIF-1α、VEGF的相关性分析(见表4)。

2.5 HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达的相关性,见表5。

表3

VEGF蛋白在正常唾液腺组织、多形性腺瘤、腺样囊性癌中的表达

分组例数VEGF表达

-+++

正常唾液腺组织109(90.00%)1(10.00%)0(0.00%)

多形性腺瘤1311(84.70%)1(7.65%)1(7.65%)

腺样囊性癌3512(34.30%)14(40.00%)9(25.70%)

注:r=0.498,P

表4

MVD在腺样囊性癌中计数差异及HIF-1α、VEGF表达与MVD的关系

阳性强度例数HIF-1α组F(P)例数VEGF组 F(P)

-1030.84±4.251229.65±4.57

+1544.25±4.701445.80±4.81

++1052.40±5.545.56(

表5

HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达的相关性

HIF-1α表达

VEGF表达

-+++

合计(例数)

-91010

+210315

++13610

合计(例数)1214935

HIF-1α与VEGF相关性经 Spearman检验,相关系数r=0.69, P

3 讨论

现有研究认为肿瘤细胞的快速生长使之大部分具有缺氧的微环境,HIF-1α是介导肿瘤细胞缺氧适应的关键性转录调控因子,表达的调控主要受低氧调节,与肿瘤细胞凋亡、增殖、代谢、耐药和血管生成密切相关。在多种恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤组织中均存在HIF-1α的过表达,并与肿瘤预后密切相关[5,6]。本实验发现,HIF-1α在腺样囊性癌中的表达阳性率比正常涎腺组织、多形性腺瘤高(表1),与HIF-1α在全身大多数恶性肿瘤中的过表达相符,而HIF-1α在部分多形性腺瘤也有表达,提示细胞缺氧可能出现在恶变之前,并持续到肿瘤恶性转变全过程,HIF-1α在预测腺样囊性癌恶性程度和预后方面有检测意义。

新生血管的形成,对肿瘤的增殖、侵袭和转移密切相关,并影响预后。有研究发现恶性肿瘤中HIF-1α的过表达与微血管密度相关,HIF-1α的高表达可调控肿瘤血管形成[7]。Wei等[8]研究发现HIF-1αmRNA的表达水平与CD34的表达水平密切相关。本实验中腺样囊性癌的MVD计数与多形性腺瘤、正常唾液腺组织相比有差异性(表2),腺样囊性癌MVD计数随着HIF-1α表达的增强而升高(P

笔者在前期研究中发现VEGF是刺激腺样囊性癌新生血管的关键因子[9]。目前随着研究的深入,认为在肿瘤组织缺氧微环境下,HIF-1α活性升高,可增强其下游靶基因如VEGF的表达,促进肿瘤血管生成和细胞能量代谢,从而影响肿瘤的发生发展[10]。Burke等 [11]证实单核细胞从血液进入肿瘤中分化成巨噬细胞,巨噬细胞表达HIF-1α增加,HIF-1α在缺氧的区域处聚集,HIF-1α至细胞核内与缺氧反应元件(HRES)结合来编码VEGF等基因,继而促进肿瘤血管的新生。有研究表明,敲除HIF-1α基因或阻断HIF-1α转录可使肿瘤细胞不分泌VEGF,抑制肿瘤新生血管的形成[12]。本实验中笔者发现,HIF-1α与VEGF相关性经 Spearman检验,相关系数为0.69 ,P

本研究初步证实HIF-1α和VEGF在腺样囊性癌中存在高表达,有表达相关性。在调节机制上,HIF-1α可能通过调节其靶基因VEGF的表达,促进腺样囊性癌微血管的生成,影响腺样囊性癌的生长、侵袭和预后。HIF-1α和VEGF、MVD可以作为腺样囊性癌预后的重要指标,为临床上通过阻断HIF-1α和VEGF靶点治疗腺样囊性癌提供了依据。

参 考 文 献

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