高住低练大鼠肝细胞凋亡与bax,bcl-2和HIF-1α之间的关系

摘 要:探讨“高住低练”肝细胞凋亡与凋亡调控基因(包括HIF1α)之 间关系,为低氧训练提供科研资料。方法:健康成年雄性SD大鼠60只,随机分为6组。安静 对照组(C)不训练,不进行低氧暴露;低氧暴露组(HE)和高住低练组(Hilo)每天低氧 暴露(氧浓度12.6%,相当于海拔4 000 m)8 h和12 h,5 d/周,共4周;常氧运动组和高 住低练组每天均以25 m/min的速度训练1 h,5 d/周,共4周。采用免疫组织化学方法和计算 机显 微图像分析系统分析bax、bcl2和HIF1α阳性表达、阳性物质的定位及定量。结果:1)与C组相比实验各组细胞凋亡指数著性升高(p

关键词:高住低练;肝细胞凋亡;凋亡调控基因;低氧诱导因子1α

中图分类号:G804.7文献标识码:A文章编号 :1007-3612(2010)01-0062-05

Relation of Living High/Training Low on Hepatic Apoptosis betwee n Bax, Bcl2 and HIF1α in

SpragueDauley Rats

LIU Wenfeng1, LU Jianqing2, QU Shulin1, TANG Changf a1, LI Jianghua3

(1.Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan China; 2. Xi angnan College, Chenzhou 423000, Hunan China;

3. Jiangxi Normal Universi ty, Nanchang 330027, Jiangxi China)

Abstract: This research studies hepatic apoptotic gene, and applies research dat a for hypoxic training in sports practice applications. It attempts to explore t he relation between apoptotic gene and apoptosis on living high/training low. 60male SD rats are randomly divided into six groups. Group C do not hold hypoxiaand training. Groups HE and Hilo are held in hypoxia chamber (12.5% concentratio ns of oxygen, simulated as a altitude of 4 000 m) with 8h and 12h each day, 5 da ys per week for 4 weeks. Groups T and Hilo are trained at the speed of the 25 m/ min for 1 hour each day, 5 days per week for 4 weeks. Immunohistochemical and co mputer image processing technique are applied to detect positive expression andquantificational analysis for HIF1α,bax and bcl2 protein. As compared withgroup C, the index of apoptosis increases significantly in other experimental g roups(p

Key words: living high/training low; liver apoptosis; apoptotic gene; HI F1α

肝细胞凋亡是个多基因调控的复杂过程,其产生的机制至今尚未完全清楚。目前的研究 多与bcl-2家族有关,bcl-2/bax和bax/bal-xl可抑制细胞凋亡,bax/bcl-2、bax/bax和bax/ bal-xl可促进细胞凋亡[1-4]。bax的作用与bcl-2相反,促进细胞凋亡,许多细胞 的凋亡过程中常伴有bax表达水平的升高,如Kobayashi等[5]转染bax时发现不仅能 够诱导许多细胞发 生自发凋亡,而且可以促进多种因素诱导的多种细胞凋亡。有报道轻度低氧时,激活的HIF- 1α可与HIF-1β相结合,形成异二聚体,可能促进了其目的基因如EPO、VEGF等生成从而可 能促进低氧组织细胞存活;但低氧严重而持续时间长时,HIF-1α可以与P53相结合,从而可 能促进了低氧诱导的凋亡[6]。目前已确定有超过70个基因被HIF-1调控[7] 。而关于“高住低练”肝组织HIF-1α和凋亡相关基因之间关系、凋亡调控基因情况,目 前尚未见到报道。

本实验采用不同持续时间低氧暴露后运动的大鼠实验动物模型,采用TUNEL检测细胞凋 亡,免疫组织化学的方法检测HIF-1α、bax和bcl-2蛋白表达,探讨“高住低练”对肝细胞 凋亡与凋亡调控基因(包括HIF-1α)之间关系的研究,为低氧训练手段在运动实践中的科 学应用提供研究资料。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

健康成年雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠60只,体重(212.55±15.74)g(购自湖南农业 大学动物中心,许可证号:湘scxk 2003- 003),为清洁级实验动物。以国家标准啮齿类动 物饲料分笼饲养,自由饮食和饮水。实验期间室温为20℃～25℃,相对湿度为45%～55%,每 天光照12 h。

适应性喂养1周后,大鼠按体重随机分为6组,每组10只,即正常对照组(Control grou p,C)、8 h低氧暴露组(8 h hypoxic exposure group,8hHE)、12 h低氧暴露组(12 hhypoxic exposure group,12 h HE)、常氧运动组(purely training group,T)、8 h高 住低练组(8 h Living High-Training Low group,8Hilo)和12 h高住低练组(12 h Livi ng High-Training Low group,12Hilo)。

1.2 实验方案

1.2.1 运动训练安排T和Hilo组采用杭州立泰科技有限公司PT动物实验跑台,每天以25 m/min的速度训练1 h ,每天训练1次,每周5天,共4周。C组和HE组不做动物实验跑台运动。

1.2.2 低氧处理适应一周后,密封低氧帐篷内为固定的12.6%(相当于海拔4 000 m高度)氧含量,8 hHE组 和8Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中每天放置8 h,12 hHE组和12Hilo组大鼠于密封低氧帐篷中 每天放置12 h,每周5天,共4周。C组和T组不做低氧处理。

1.3 标本制备

实验结束后,用0.1%戊巴比妥钠1 mL/100 g麻醉大鼠,断头处死。迅速取肝左侧叶,按照长 宽高为5 mm、3 mm、5 mm的标准取样,置于4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1M,pH7.4 PBS) 中固定24 h后进行常规石蜡包埋,每个蜡块每隔20 μm连续切片5张,每张厚5 μm,用于免 疫组织化学和TUNEL检测。

1.4 原位细胞凋亡检测应用TdT进行的末端反应又称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(T UNEL)检测细胞凋亡,按原位细胞凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit, POD)说明书操作。

光学显微镜下阳性凋亡细胞表现为细胞核呈棕黄色或棕褐色着染,部分胞浆也可因胞核 DNA碎片溢出而呈阳性着染;正常非凋亡细胞和阴性对照细胞核被苏木素复染成蓝色,核相 对较大,形态大小一致。根据下列标准确定着色阳性细胞为凋亡细胞:1) 单个散在分布 ;2) 具有凋亡的核形态;3) 周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞,除非 染色强度与背景有鲜明对比,且呈单个分布,否则不认为是凋亡细胞。光学显微镜(×400 )下每张切片随机观察6个视野,每个视野至少500个细胞水平。以Simple PCI显微图像分析 软件测试每100个细胞中的平均阳性凋亡细胞数,即凋亡指数(Apoptosis Index,AI)[8]。

1.5 bax、bcl-2和HIF-1α的免疫组织化学的测定对肝脏组织中bax、bcl-2和HIF-1α进行定位、定性和定量的研究。具体步骤如下:石蜡切 片脱蜡脱水;用3%的H2O2室温孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶;置0.01 mol/L,pH 6.0的柠檬酸(又叫枸橼酸)中,用WD900 AS25 R-2型号Galanz(格兰士)微波炉抗原热修 复,PBS液冲洗5 min×3次,自然冷却;5%～10%山羊血清室温孵育10 min,减少或消除非 特异性染色;滴加50 μL一抗(购自美国Santa Cruz公司)(1:50),置4℃冰箱过夜;室 温孵育15 min,PBS液冲洗5 min×3次;滴加二抗(PV6001/6002二步法检测试剂,购自北京 中杉金桥生物工程有限公司),37℃恒温箱中孵育30 min(烤片);PBS液冲洗5 min×3次 ,用终浓度为0.05%DAB- 0.03% H2O2显色4～5 min,PBS液充分冲洗;苏木素常规染色4 ～5 min,1%的盐酸酒精分色数秒;烘干,中性树胶封片。阴性对照:用PBS代替一抗作为空 白对照。

计算机显微图象分析系统为美国COMPIX Simple PC6.0I生物显微分析图像系统。每组选 片10张,每张切片镜下(×400)随机取5个视野进行分析,bax、bcl-2、HIF-1α的阳性物 质用灰度值(光密度值)和阳性表达面积表示,阳性产物的表达采用一定面积中光密度值与 阳性面积值的乘积做为阳性指数(positive index,PI),即阳性指数=阳性强度光密度值 ×阳性反应面积/测量面积[8]。

1.6 统计学分析所有的数据用平均值±标准差表示;各组间显著性差异采用方差分析、组内显著性差异用双 侧t检验,采用Prarson计算方法进行相关分析;在满足方差齐性条件下使用LSD法(Leas t-significant Difference)和SNK法(Student- Neuman-Keuls)进行多重比较;显著性水平 为α=0.05;所有数据均用SPSS11.5统计学软件进行处理。

2 结 果

2.1 “高住低练”对大鼠一般活动情况及体重的影响安静对照组大鼠形态正常,皮毛光亮,眼睛有神,反应灵敏,进食饮水正常。低氧舱中 的大鼠反应较为迟钝,表现比较兴奋,有用前爪抓或嘴巴咬笼子现象,进食相对减少,低氧 暴露第二周开始没有出现明显不良反应。除安静对照组大鼠外,对光线,声音,搬动笼子较 敏感,训练各组的大鼠进跑台时有逃避现象。

实验各组大鼠体重呈现纵向增长,随着低氧暴露、常氧运动及高住低练依次体重呈现横 向下降趋势(图1)。

处死后解剖大鼠时,肉眼发现安静对照组的皮下脂肪、肠系膜等比其他组丰富,高住低 练组的为最少。

2.2 “高住低练”大鼠肝细胞凋亡的结果与C组相比,HE组、T组和Hilo组细胞凋亡指数显著升高,具有非常显著性差异(p

2.3 “高住低练”大鼠肝组织bax、bcl-2及bax/bcl-2的结果

2.1.1 大鼠肝组织bax免疫组织化学染色显微图象观察与分析结果 bax蛋白主要表达于细胞浆,也有可见细胞膜和细胞浆同时着色,呈淡棕黄色或棕色, 呈镞状分布和(或)片状分布。切片内阳性细胞率

与C组相比,低氧暴露能促进bax蛋白表达增加(p

2.1.2 大鼠肝组织bcl-2免疫组织化学染色显微图象观察与分析结果 bcl-2蛋白阳性信号主要定位于细胞浆和细胞膜,为棕黄色,略呈颗粒状。不论低氧、 运动及低氧训练都能促进bcl-2蛋白表达。切片内阳性细胞率

与C组相比,实验各组的bcl-2蛋白表达都显著性意义(p

2.1.3 大鼠肝组织bax/bcl-2值 肝组织bax/bcl-2值显示,C与12 hHE组和12Hilo组相比,具有显著性意义(p

2.2 大鼠肝组织HIF-1α免疫组织化学染色显微图象观察与分析结果 C组肝组织偶见较弱的HIF-1α免疫阳性表达;8 hHE组肝组织可见HIF-1α免疫阳性物质主要 表达于胞浆中,部分胞核中,并分布于肝窦静脉周围;12 hHE组肝组织可见HIF-1α免疫 阳性物质较强表达,主要位于细胞核,细胞质也有少量表达;T组肝组织可见HIF-1α免疫阳 性物质表达;8Hilo组肝组织可见较多的HIF-1α免疫阳性物质主要表达于胞浆中,部分在胞 核中,并且阳性细胞分布于肝窦静脉周围;12Hilo组肝组织可见大量的HIF-1α免疫阳性物 质主要表达于胞浆中,部分在胞核中,并且阳性细胞分布于肝窦静脉周围。

与C相比,不论是HE组、T组或者Hilo组都能促进HIF-1α蛋白表达增加,并具有显著性差异 (p

2.3 “高住低练”大鼠肝组织TUNEL与bax、bcl-2和HIF-1α之间的相关分析

2.3.1 bax、bcl-2、HIF-1α与TUNEL相关分析结果[8]肝细胞凋亡与bax呈高度正相关,相关系数r=0.693(P

2.3.2 肝组织bax、bcl-2与HIF-1α相关分析结果

HIF-1α与bax呈高度正相关,相关系数r=0.958(P

3 分析与讨论

3.1 “高住低练”对大鼠肝细胞凋亡调控基因bax、bcl-2的影响 本实验结果显示:与正常对照组相比不论是单纯低氧暴露、常氧运动及高住低练都能促 进bcl-2和bax蛋白表达增加(p

3.2 “高住低练”对大鼠肝组织HIF-1α的影响本实验结果显示只考虑单纯低氧暴露,低氧暴露能促进HIF-1α蛋白表达增加(p

本实验结果显示常氧运动也能促进HIF-1α蛋白的表达(p

本实验结果显示高住低练都能促进HIF-1α蛋白表达增加(p

3.3 “高住低练”大鼠肝组织bax/bcl-2与HIF-1α之间的关系HIF-1α对细胞凋亡的影响近年国外渐有报道。有报道说HIF-1在阻止细胞凋亡中起作用 。HIF-1诱导VEGF的表达在保护造血干细胞和阻止神经元细胞凋亡中的作用已被证实[1 9]。但有研究表明HIF-1在细胞凋亡中起促进作用。Carmclieit等[20]将野生型 (rHIF-1α+/+)胚胎干细胞(ES)和利用同源重组方法获得HIF-1α缺陷(rHIF-1α-/-) 的ES细胞同时给予低氧处理后与常氧对照组比较,rHIF-1α+/+ES中凋亡细胞增加10- 30倍, 而rHIF-1α-/-ES的凋亡却未受低氧的影响。于如同等[21]的实验表明,大 鼠颅脑创伤后继发性脑组织缺血、 缺氧可引起细胞凋亡,HIF-1α对细胞凋亡有促进作用。还有研究发现低氧后在大鼠的心肌 细胞有HIF-1α的表达,同时也发现有凋亡相关基因BNIP3的明显表达,从而启动细胞凋亡的 过程,而且这种类型的心肌细胞凋亡不被caspases抑制剂所缓解[22]。

本实验结果显示,TUNEL与HIF-1α呈高度正相关(r=0.770,p

4 结 论

Bax、bcl-2与HIF-1α基因参与调控肝细胞的凋亡,HIF-1α与肝细胞凋亡呈高度正相关 ,HIF-1α可能调控bax和bcl-2,并与bax高度相关,调控bax高表达而促进肝细胞凋亡。

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