P24在HIV感染者和艾滋病患者检测中的应用

关键词：艾滋病；P24抗原；窗口期；免疫复合物

中图分类号：R512.91

文献标识码：A

文章编号：1007-2349（2011）10-0028-03

获得性免疫缺陷综合征（Acquired ImmunoDeficiency Syndrome）简称艾滋病（AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染机体所引起的一种严重的传染性疾病。目前该疾病已从在高危人群传播逐步转化为在一般人群传播，因此艾滋病的预防与控制成为医务和研究工作的重要部分。对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等［1］。机体感染HIV后，P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志，感染后约2～3周即可检出，1～2个月左右进入抗原高峰，然后随着机体抗体的逐渐产生，由于抗体的中和作用，形成抗原抗体复合物，而游离性抗原很少，甚至会低于监测水平，机体进入无症状感染期。疾病后期，随着病毒的复制增强，免疫系统逐渐破坏，P24抗原水平会再次提高作为HIV活动性感染的标志。而HIV抗体的检测存在一个窗口期，一般平均为2～3个月，但95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内［2］。P24抗原在血清抗体阳转前2 d～18 d即可检测到，因此HIV-1 P24抗原检测可作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断［3］，也可检测疾病进展、进行药物疗效评估等。

1 P24的组成特点

P24抗原是HIV的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用，缺失P24病毒将无法正常组装。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组，为球形颗粒，直径约100~120 nm。典型的HIV-1由核心和包膜两部分组成，核心包括两条正股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，病毒复制所必须的酶类包括逆转录酶（P51，P66）、整合酶（P32）和蛋白酶（P11）。核心外面为病毒衣壳蛋白（P24、P17）。病毒的最外层为包膜，其中嵌有gp120和gp41两种特异性糖蛋白。HIV基因全长约9.8kb，含有3个结构基因（gag、pol和env）、2个调节基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子）和4个辅助基因（负调控因子、病毒r蛋白、病毒u蛋白和毒粒感染性因子）。在HIV病毒3个结构基因中，env的变异率最高，gag和pol比较保守。P24蛋白是gag基因编码55kD的前体蛋白经pol基因编码的蛋白酶的加工后产生的，因此P24蛋白氨基酸顺序在HIV各病毒株之间高度保守，使P24在HIV-1感染的检测中有一定的实用价值。

2 P24的临床应用

P24抗原检测技术是常用的HIV抗原检测。在下面几种情况中具有重要的作用。

2.1 HIV感染早期 抗体出现前的一段时期称为窗口期，处于窗口期的艾滋病病毒感染者血液中虽检测不到抗体，但血液、、阴道分泌物、乳汁等体液中含有艾滋病病毒而具传染性。在此期间：血清HIV抗体阴性，可检测到病毒RNA和病毒衣壳蛋白P24抗原，还有变化的CD4+T淋巴细胞水平。P24抗原检测是HIV早期感染检测的重要手段。在HIV抗体检测中，遇到2种初筛试验均为阳性或一阴一阳而WB阴性时，不能轻易报告阴性，尤其是近期有高危行为者或有急性流感样症状者。为排除窗口期的可能，可以进行HIV-1 P24抗原或HIV核酸检测，并于2~3个月后复查抗体，以减少漏检率。

2.2 监测病程进展和预后的判断 病毒蛋白P24抗原的增加与病毒的复制相平行。当P24抗原浓度再次在血清中升高，意味着病毒的大量繁殖和免疫系统的破坏，提示感染者进入或即将进入艾滋病期。监测P24浓度变化可以反映病情进展，为控制和治疗艾滋病提供试验依据。

2.3 HIV抗体不确定 P24抗原是HIV确证试验蛋白印迹法（WB）试剂条带中的重要组成部分。WB法HIV-1 抗体阳性：检测出两条env带（gp160/gp41和gp120）及gag带（P17 、P24 、P55）或Pol带（P31 、P51 、P66）。WB法中，条带P66和P24，检出率较高，可作为常见的反应抗原，特别是P24抗原，检出率达100%。有研究［4］表明，没有HIV 感染危险的献血员发生WB 不确定结果的频率大于20 %，主要是针对P17 和P24 的反应。另有研究［5］指出，在没有HIV 感染的人群中，HIV-1 的P24 抗体阳性率分别是：健康人群0.67 %，普通患者13 %，表皮T 细胞淋巴瘤患者24 %，孕妇0.1 %。这些结果显示：HIV 抗体不确定结果比较常见。不确定结果绝大多数是非特异性反应，一般可能与血清标本的加热、高胆红素水平、溶血、类风湿因子、系统性红斑狼疮、多次输血或使用血液制品等因素有关，还可能与HIV 病毒抗原与宿主细胞成分的相互交叉反应有关，也与受检者个人的生活环境有紧密关系。

2.4 鉴定新生儿感染，预测母婴垂直传播的可能性 HIV阳性孕妇所产下的婴儿体内可能含有来自母体的抗体，抗体检测易出现假阳性。而 P24抗原检测可用于鉴定婴儿是否感染，在HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当，与HIV核酸检测具有可比性，具有重要的实用价值。

2.5 药物疗效评价 随着技术的进展，检测灵敏度不断提高，P24抗原的检测逐渐从主要用于窗口期辅助诊断，发展到用于临床疗效评价。我国HIV感染者和艾滋病患者大部分是在基层且分布广，病毒载量检测费用高，对仪器和操作人员要求也高，很难在基层普及，很大地阻碍了疾病的控制。P24抗原检测成本低、操作简单，易于普及。

3 P24抗原的检测

HIV-1 P24抗原检测主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫荧光分析技术（IFA）等技术。其中酶联免疫吸附试验（ELISA）测定P24抗原技术是检测HIV感染最敏感的方法。其原理是用已知抗体包被固相载体，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与抗体结合形成抗原抗体复合物，再加入酶标记抗体与抗原结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，在酶标仪读取结果。此法易受干扰物质影响产生假阳性，因此需用中和试验加以验证。由于HIV-1感染者P24抗原含量少且在病情发展过程中形成抗原抗体复合物影响P24抗原检出，另外方法灵敏度低，使P24抗原在HIV感染诊断中与病毒核酸检测相比没有优势。近年来，新的抗原检测方法大幅度提高了检测灵敏度［6］，主要有以下几种。

3.1 免疫复合物裂解检测法（ICD） 该法是用酸、碱处理或加热的方法使抗原抗体复合物分离，从而增加P24抗原的浓度，提高P24检测的敏感性和阳性检出率，热处理方法比酸碱处理方法更能提高P24的阳性检出率。一般认为P24-ICD 的检测敏感性为90 %［7］。

3.2 超敏感酶免疫测定法（UEI） 该法是利用高亲和力抗体浓缩富集血清中的P24抗原，然后进行检测P24。该法敏感性好，特异性强，检测阀值为0.24 pg／mL，并且与HIV抗体的ELISA检测相比，可提前12~20 d检测到P24抗原。

3.3 免疫吸附电镜法（ISEM） 该法是将抗原与抗体的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，实现对病毒颗粒或病毒可溶性抗原的直接特异性检测，灵敏度高，但需要精密仪器，操作较复杂。

3.4 线性免疫酶测定（LIA） 是第4代HIV抗原检测技术［8］，具有较好的敏感性，缩短了检测窗口期3～6 d，特异性高达99.84%，检测阈值为0.01pg/mL。

3.5 荧光联结抗原定量法（FLAQ） 该法是将抗P24／P27单克隆抗体包被的聚苯乙烯微球与待测样品、荧光标记物的抗P24／P27以及裂解液混合后孵育，再借助流式细胞仪直接测定单个微球上的荧光强度，不需洗去未结合的检测抗体，再做出标准曲线对P24／P27抗原进行定量分析［9］。该方法操作简单，实用性强，检测限为0.1～100 ng／mL。

4 P24抗原的应用总结

在人体感染HIV后的10～14 d内，病毒RNA水平是呈指数上升，之后下降并保持在持续稳定的水平，机体进入HIV无症状期［10］。P24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展，在急性感染期就可出现，被认为是病毒复制的间接性标志。P24的氨基酸序列高度保守，临床检测稳定，其出现又早于抗体，可作为HIV早期感染的重要指标，是窗口期的主要检测手段之一。P24的常规检测方法是ELISA，新的灵敏度高的方法主要有免疫复合物裂解检测法（ICD）、超敏感酶免疫测定法（UEI）、免疫吸附电镜法（ISEM）和线性免疫酶测定（LIA）。用高灵敏度的P24检测方法诊断艾滋病将有助于疾病早期诊断，避免漏检，同时可对治疗艾滋病药物进行疗效评估、判断预后和监测疾病进程，也在预防母婴垂直传播和抗体不确定等方面有一定用途，并已应用在第四代艾滋病检测的ELISA试剂盒中，临床价值较大。2004年来自美国马里兰大学的Dr.Gallo［11］的实验室的1篇有关高灵敏度检测P24抗原的研究综述指出：P24抗原检测方法的灵敏度得以大幅提高，并认为这可以作为低成本、适合在发展中国家使用的替代昂贵的RNA测定方法的一种方法。目前P24抗原的检测灵敏度仍较低，还不能完全替代病毒RNA测定。进一步提高检测的灵敏性，是P24诊断方法改进和试剂开发的主要方向。

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（收稿日期：2011-06-17）