“基因工程”考点分析

随着人类逐渐认识了基因的结构与组成、基因的操作工具限制酶与连接酶，掌握了基因的体内复制和体外扩增（PCR）的规律，拥有了DNA分离的技术，基因工程作为一门新技术应运而生。基因工程这种新的现代生物技术也是近年高考的重点、难点和落脚点。

笔者根据课标要求，结合考纲和近年高考考点将近年基因工程考点总结如下。

一、 基因工程的基础知识

基因工程的理论铺垫――分子生物学发展：

① 艾弗里证明了DNA是遗传物质。

② 沃森和克里克证明了DNA双螺旋结构。

③ 尼仑贝格破译了遗传密码。

二、 酶切

基因工程选择限制性内切酶作为工具，主要是因为它具有比一般酶更高的专一性。由于其具有较高的专一性，因此在基因工程的具体操作中如何选择限制性内切酶是高考的重点考察内容。

1. 限制酶的特异性

例1 判断用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸是否可行？_____。

答案 不可行

解析 限制酶的专一性非常强，其特异性表现在三个方面：识别DNA、识别特定序列（回文）、切割特定位点磷酸二酯键。由于烟草花叶病毒是RNA病毒，所以限制酶不能识别RNA。

另外要特别注意限制酶切割以后的结果，磷酸二酯键断裂，暴露出新的磷酸基团。

2. 限制酶的选择

正确选择限制酶是基因工程中一件非常重要的任务。限制酶的选择应当遵循以下一些原则：不破坏目的基因；不破坏标记基因；目的基因和运载体上都有限制酶的切割位点。当然也要注意用一种限制酶和两种限制酶切割的区别。

例2 与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_________

______________________。

答案 质粒和含目的基因的外源DN段自身环化

解析 基因工程中目的基因和质粒可以用同一种酶切，也可以用两种酶切，若用一种酶切，质粒只要切一个切口，目的基因需要切两个切口；若用两种酶切，质粒要切两个切口，目的基因也需要切两个切口。一种酶切出的4个切口都相同，所以有多种连法，两种酶切出的质粒和目的基因上的4个切口两两相同，因此可以防止自身环化。

3. 同尾酶

限制酶种类多样，一些酶之间关系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ识别不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它们切出的末端可以连接，被称为同尾酶。

例3 已知限制酶I的识别序列和切点是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。根据下图示判断下列操作正确的是（ ）

A. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

C. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割

D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割

答案 A

三、 连接

1. 连接物类型

经过限制酶切割过以后，暴露出的相同的黏性末端可以自动连接，考生同时需要考虑：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因两端的两个黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；质粒上的两个黏性末端。综合以上结论，连接产物的类型可能就比较多，如目的基因-目的基因连接物、目的基因-运载体连接物、运载体-运载体连接物、其他DN段-运载体连接物、目的基因自连、运载体自连，若用同一种酶切时后两种连接物不存在。

2. 连接酶

下表简要总结了基因工程中常见酶的特性差异。

例 PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_____________

___________________。

答案 DNA聚合酶只能将单核苷酸连接到双链DN段的引物链上

解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么连接酶能否催化以上反应呢？也不能，因为连接酶必须将两段DNA相连。RNA聚合酶能否催化以上反应呢？也不能，因为RNA聚合酶虽然不要引物，但其不能催化T参与反应，只能利用U。虽然这些酶都是催化磷酸二酯键，但它们作用的底物差异较大，所以一定要注意辨析。

以上主要介绍了基因工程的三种操作工具，这些内容当然是高考的重点和热点。除此之外有些内容也应当给予一定关注，如：目的基因的获取；目的基因的扩增（PCR）；土壤农杆菌介导的目的基因的导入；重组质粒的筛选；目的基因的检测；转基因生物的安全性；转基因生物的利用等问题。

巩固训练

1. 目前人类利用基因工程的方法成功培育出转基因抗虫棉，以下说法正确的是

（ ）

A. 标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因

B. 抗虫基因导入棉花叶肉细胞后，可通过传粉、受精的方法，使抗虫性状遗传下去

C. 苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因与质粒结合后直接进入棉花的叶肉细胞表达

D. 转基因抗虫棉经过种植，棉铃虫不会产生抗性，这样可以有效消灭棉铃虫

2. 下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。

（1） 将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X-1混合连接，连接后获得的质粒类型有______。（可多选）

A. X-1 B. X-2

C. X-3 D. X-4

（2） 若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有____________、____________。

（3） 如果X-1用E1酶切，产生850对碱基和3 550对碱基两种片段：那么质粒X-2（Tcr基因的长度为1 200对碱基）用E2酶切后的片段长度为______对碱基。

（4） 若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X-1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X-4的细胞数与含X-1的细胞数之比为13，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________

________________________。

3. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。请回答下列问题：

（1） 将提取的质粒与外源DNA分别加入缓冲液中，选用相应的限制酶处理时，影响处理效果的外界因素主要是______等（写出两点）。

（2） 用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA？答：______，原因是______

___________________________。

（3） 可选用______（两种）限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得______种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含______的培养基上培养。

（4） 为了从基因文库中分离获取T2噬菌体抗性基因，将重组质粒导入对T2噬菌体敏感的大肠杆菌，然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有______的培养基上培养，从而初步检测目的基因的表达。

答案

1. A 2. （1） ABC

（2） 无质粒细胞 含X-3的细胞

（3） 4 750

（4） 不能 DNA连接酶对DN段没有选择性或者DNA末端相同

3. （1） 温度、pH

（2） 不能 MspⅠ会切割质粒上的两个标记基因，而BamHⅠ会切割破坏目的基因

（3） KpnⅠ、SmaⅠ 2 新霉素

（4） T2噬菌体