舌癌浸润方式与SPF的关系研究

本文作者：高志彪 冯正虎 杨兰 黄喆 单位：兰州大学第二医院口腔科 西北民族大学医学院

舌癌以其浸润性强，转移速度快，治疗效果差等生物学特点颇受学术界关注。近年的研究［1－3］表明，在众多的组织学特征中，癌灶的浸润方式更能反映肿瘤的生物学行为。众所周知，肿瘤是细胞变异的结果，恶性肿瘤细胞无限制地生长、细胞核增大、核内染色质增多，其实质是细胞核内DNA不断复制的结果。国内外大量病理和临床资料已经证明，检测恶性肿瘤细胞DNA含量与倍体已成为目前研究肿瘤生物学特性及估计患者预后的热点问题。本课题拟从肿瘤－宿主边缘瘤细胞浸润分型出发，研究不同浸润方式舌癌细胞DNA倍体及细胞周期中S期细胞比例，从分子水平揭示舌癌生物学行为。

1材料与方法

1．1临床资料及标本处理收集兰州大学第二医院和西北民族大学口腔医院病历资料完整的病理确诊为舌癌的43例存档蜡块，所有患者术前均未行放化疗。其中男28例，女15例，年龄34～72岁。所有蜡块作5μm厚组织切片，行常规HE染色，阅片采用双盲法，由2位有经验的病理科医师按Anneroth等［4］介绍的方法浸润分型和肿瘤组织病理分级分类(WHO1997标准):Ⅰ型14例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10例，Ⅳ型6例;病理分化程度:高分化23例，中、低分化20例。其中淋巴结转移17例，未转移26例。浸润分型后，所有蜡块重作50μm厚组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，胃蛋白酶消化，过滤，离心，漂洗，75%酒精固定，备检。

1．2单细胞悬液DNA荧光染色及上机检测备检样品离心、去上清、漂洗后用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量荧光染色，4℃避光反应30min，用美国BECKMANCOULTE公司的EpicsXL型流式细胞仪上机检测，上机前需校正仪器，使其峰值的分辨率(CV值)在5%以内。以正常舌体组织作对照。

1．3分析指标用ModFitLT分析软件分析DNA倍体、细胞周期，依据DI值判定DNA倍体，0．9≤DI≤1．1为DNA二倍体;DI＜0．9或＞1．1为异倍体。DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常舌体二倍体细胞G0/G1峰道数，DNA异倍体的判定:在DNA直方图上出现明显的2个峰且异倍体细胞群至少应含20%的细胞或核同时DI＜0．9或DI＞1．1，同时测定SPF，SPF(%)=［S÷(G0/G1+S+G2/M)］×100%。

1．4统计分析采用统计学软件SPSS10．0对计量资料进行t检验，计数资料进行χ2检验。检验水准取α=0．05。

2结果

2．1浸润方式与淋巴结转移的关系根据临床病理资料统计，43例舌癌病例中有淋巴结转移者17例，其中Ⅰ、Ⅱ型浸润方式淋巴结转移者7例，阳性率为25．93%(7/27);Ⅲ、Ⅳ浸润方式型淋巴结转移者10例，阳性率为62．50%(10/16)。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型与Ⅲ、Ⅳ型之间淋巴结转移率差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．2浸润方式与肿瘤组织病理分化程度关系27例Ⅰ、Ⅱ型浸润方式者中，高分化20例，中、低分化7例;16例Ⅲ、Ⅳ型浸润方式者中，高分化3例，中、低分化13例。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型之间病理分化程度差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．3浸润方式与DNA倍体、SPF之间的关系43例舌癌中，二倍体肿瘤18例，占41．9%，异倍体肿瘤25例，占58．1%，各浸润分型异倍体所占比例及SPF均值见表1。研究结果显示:随着浸润分型的发展，异倍体肿瘤检出率及SPF逐渐上升，经统计学分析，差异有统计学意义(P＜0．05)。

3讨论

DNA倍体是指一个个体细胞所含染色体组的数目，单倍体细胞是仅含一个染色体组的细胞，二倍体细胞是含2个染色体组的细胞，多倍体则含2套以上单套染色体的重组基因。人体除肝脏、心肌、生殖细胞外，一般都有严格恒定的二倍体细胞DNA含量，大于二倍体的整倍体(四倍体除外)或非整倍体的染色体数目总称为异倍体(heteropolid)［5］。现学术界公认非整倍体是细胞恶化的特征性标志之一，文献报道异倍体肿瘤细胞分化程度低，浸润性强，5年生存率远较二倍体肿瘤低［6］。所以有学者从细胞核的重要遗传物质DNA着手，检测瘤体细胞内DNA含量变化及其倍体类型、倍体异质性等，从肿瘤细胞增殖动力学方面探讨肿瘤个体的生物学行为［7－8］。近年来，在头颈部肿瘤的研究中，发现肿瘤－宿主边缘的浸润方式与肿瘤的生物学行为关系密切，以小细胞群或单个细胞弥散侵袭者恶性程度更高，转移速度更快［3，9］，这种在同一肿瘤内以不同浸润方式作为表现形式的瘤细胞亚群，可能是肿瘤演化过程中形成的新的克隆，这些瘤细胞DNA倍性如何，尚未见相关文献报道。本实验结果显示各浸润分型DNA异倍体率各不相同，差别有统计学意义。这说明肿瘤在发展过程中以基因为基础的变化可能与其浸润方式有关。Arnerlv等［10］对处于瘤体不同部位的DNA倍体状态的研究，发现转移潜能较大的亚群较转移潜能较小者具有更高的异倍体率。这说明肿瘤在发展过程中，由于基因突变造成肿瘤细胞遗传的不稳定性，从而导致了肿瘤在其演进过程中失去单克隆而获得遗传异质性，结果瘤体内出现了浸润性更大、转移能力更强的新的肿瘤细胞克隆，使肿瘤的恶性程度趋于更高。本课题组前期研究结果显示舌癌浸润分型较高者侵袭性更强，恶性度更高，这种以不同浸润方式作为表现形式的瘤细胞亚群，可能是肿瘤演化过程中形成的新的克隆，所以舌癌浸润方式不同其DNA倍体状态不同也不难理解。Pellman［11］认为异倍体的出现与有丝分裂时染色体重组、缺失、多重复制有关，而二倍体肿瘤可能与下列因素有关:①异倍体细胞数过少而被尚未癌变的正常细胞的二倍体峰所掩盖;②肿瘤的异质性导致肿瘤内部的发展并不均衡，病检部位与行流式细胞术(FCM)检测部位的肿瘤细胞亚群并不一致;③少数肿瘤可能同时存在染色体的丢失和复制而最终表现为正常的二倍体含量。本实验结果舌癌异倍体检出率为58．1%，与Johnson等［12］用石蜡切片制备单细胞悬液所测出的头颈部鳞状细胞癌DNA异倍体44%～86%的范围相一致，但与李永生［13］的实验舌癌检出率100%相差甚远，这可能与石蜡切片制备单细胞悬液过程中造成过多细胞碎片所致。我们前期研究发现临床分期相同的舌癌细胞具有不同的浸润方式，不同浸润方式的细胞亚群具有不同的增殖活性，浸润分型越高，反映细胞增殖指标的Ki67表达越强，淋巴结转移率更高，恶性度更高。细胞DNA周期中S期细胞的多少是决定细胞增殖水平的重要指标，S期细胞的多少预示着肿瘤的恶性程度，也客观反映了肿瘤细胞增殖的动力学规律。本实验结果显示，不同浸润方式舌癌SPF各不相同，差异有统计学意义，这从另一个角度反映了浸润分型高的舌癌组织具有较高的增殖活性，侵袭性更强，恶性程度更高，与我们的前期试验相吻合。Silverman等［14］报道在多因素的高危因素(DNA倍体类型、SPF、病理分级、临床分期)中，SPF和DNA类型为具有决定意义的高危预后因素。但本课题因随访资料缺失，5年生存率未纳入实验指标，实为缺陷。有理由相信，FCM对DNA含量和细胞周期的测定对指导临床用药、判断预后提供一个有力的手段，同时可作为肿瘤病理诊断是一个有益的补充，DNA异倍体、S期增殖率可作为恶性肿瘤诊断指标，尤其是DNA异倍体可视为癌变标志。