“围刺”对自然老化大鼠真皮羟脯氨酸含量及超微结构的影响

文章编号：0255-2930(2008)01-0061-03

中图分类号：R246.7　文献标识码：A

[摘　要]目的：探讨针刺疗法抗皮肤老化的作用机制。方法：选用18月龄大鼠腹部皮肤为研究对象，采用毫针局部围刺作为处理因素，同时设立空白组、小切口皱手术对腻组、8月龄青年大鼠组，比较其皮肤可溶性及总羟脯氨酸含量，并通过透射电镜观察其成纤维细胞的形态以及胶原纤维的排列，研究局部围刺对老化皮肤胶原纤维含量及真皮超微结构的影响，并与参考文献方法进行手术的实验结果相对照。结果：围刺后大鼠皮肤可溶性羟脯氨酸含量显著高于老年空白组，总羟脯氨酸无显著差异，电镜可见，老龄大鼠真皮成纤维细胞的细胞器减少，细胞结构退化，同时胶原纤维之间空隙加宽，老化性架桥增多，围刺治疗后其成纤维细胞活性增强，结论：围刺法可能是通过增强皮肤中成纤维细胞的活性进而增加其可溶性胶原含量来改变皮肤的老化状态。

[主题词] 围刺；皮肤／代谢；羟脯氨酸／针灸效应，皮肤／超微结构；大鼠

很多针灸临床医生发现，对面瘫的患者进行针灸治疗后，患侧的皮肤较之健侧光滑、细腻，且皱纹减少或变浅。后来发展成针灸除皱术，通常采用皱纹局部围刺的方法，往往可以消除面部的浅小皱纹，显著改善皮肤的老化外观，并因操作简便、经济实用、损伤小而易于被患者接受，在中医美容临床上应用较多。但目前一般通过医患的主观判断来描述其疗效，显然缺乏客观的判定指标。因此，本实验以18月龄的老年及8月龄的青年大鼠皮肤为研究对象，对比观察自然老化过程中皮肤超微结构的变化以及围刺的方法对大鼠皮肤超微结构的影响。

1 材料与方法

1．1　实验动物与分组

选用健康18月龄Wistar大鼠36只，体重(482±70)g，随机分为A：老年空白组，B：局部围刺组，C：手术对照组，每组12只；健康8月龄大鼠8只，体重(231±18)g，设为D：青年对照组。以上大鼠均雌雄各半，由辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物编号SCXK(辽)2004―0018。

1．2 实验方法

(1)动物饲养条件

每组动物按性别及组别分笼饲养，自然光照，在相同环境下，常规饲食喂水，无不良因素影响。适应性饲养1周后，开始实验。

(2)处理方法

①围刺组：选用0.40mmX40mm针灸针，在大鼠腹部正中选取4cm×4cm区域皮肤剪毛，将大鼠在密封罐中用乙醚麻醉，昏迷后取出捆绑于大鼠固定架上，从剪毛区域的两侧向垂直腹中线方向平刺入35～40mm，刺入层次大致在真皮和皮下组织之间，每侧5针，不行手法，然后从固定架上放开，每只鼠均单独存放在一个饲养笼中，令其苏醒后带针在笼中自由活动，留针20min，每d1次，10d为一个疗程，疗程间休息10d，共进行2个疗程。第2疗程结束后继续饲养5d，不加任何处理。

②手术对照组：按照文献方法实施真皮划痕术。术前腹腔注射乌拉坦780mg/kg，腹部同上区域剪毛，在剪毛区域靠左侧边做-2cm切口，然后用眼科剪伸入，将真皮与皮下组织剥离，用弯钩手术刀片伸入真皮下，垂直于真皮面做纵横浅表切口，切割间隔1mm左右，深度以切透真皮而不穿透基底膜为度。术后常规缝合，分笼饲养，待伤口愈合后每天同围刺组麻醉和捆绑2～3min。

③空白组和青年对照组：腹部同上区域剪毛，每天均同围刺组麻醉和捆绑2～3min。

(3)取材方法

用15％Na2S在所有大鼠腹部剪毛区脱毛，取-皮肤全层，保存于20℃冰箱中待测。

(4)指标测定

羟脯氨酸测定采用分光光度法，具体如文献。

(5)电镜标本的制作

取鼠腹部剪毛区相同部位的皮肤表皮到真皮全层，修块后投入2.5％戊二醛固定2h，取出用二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，1％锇酸固定1h，再冲洗3次，常规系列乙醇一丙酮脱水，Epon 812环氧树脂包埋，LKB-V超薄切片机切片，厚600～800A，醋酸铀枸橼酸铅染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。

2 统计学处理

测得数据采用SPSS 130.统计软件进行处理，组间差异按方差分析进行显著性检验，两两比较用LSD法。

3 结果与分析

3．1 大鼠皮肤羟脯氨酸含量比较(见表1)

(1)各组可溶性羟脯氨酸含量比较

经统计学处理，A、D组间差异有非常显著性意义(P＜0.01)，说明18月龄的老年组与8月龄的青年组大鼠相比，其可溶性羟脯氨酸的含量显著减少；B、C组分别与A组相比，差异均有非常显著意义(p＜0.01)，B、C组间差异则无显著性意义(P＞0.05)，说明局部围刺的方法可以显著增加大鼠皮肤羟脯氨酸的含量，且与手术对照组相比差异无显著性意义。

(2)各组总羟脯氨酸含量比较

经统计学处理，A、D组间差异有非常显著性意义(P＜0.01)，显示18月龄的老年组与8月龄的青年组大鼠相比，其总羟脯氨酸的含量显著增加。说明皮肤中总羟脯氨酸的含量可能是随着增龄而增加的，B、C组分别与A组相比，差异均无显著性意义，说明针刺和手术的方法都不能改变真皮的总羟脯氨酸含量，这很可能说明总羟脯氨酸含量不能作为衡量抗皮肤老化疗效的指标。

3．2 真皮成纤维细胞及胶原纤维超微结构观察

从电镜照片可见，青年对照组：成纤维细胞呈梭形或不规则形，核卵圆形，核染色较深，核内染色质均匀分布，胞质中有较多的糙面内质网，有的呈中度扩张，网池中可见到着色均匀的淡灰色絮状物；可见较多的线粒体，线粒体嵴隐约可见，溶酶体也可见到，脂褐素颗粒较少(见图1)；胶原纤维束大而规则，呈波状，纤维束间架桥较少(见图2)。老年空白组：成纤维细胞呈长梭形或扁平状，胞核占胞体大部分，核染色质聚积成块，胞质很少，有的甚至在核周形成一薄层，细胞内可见到不多的短管状糙面内质网，正常线粒体较青年组少，而变性坏死的线粒体较多，重者甚至出现空泡化，胞质内脂褐素颗粒较多(见图3)；胶原纤维束聚合，排列不规则，架桥增多，基质空间增大(见图4)。局部围刺组：在老年空白组形态学特点的基础上，成纤维细胞亦可见空泡化的线粒体，但内质网有的呈轻度扩张，细胞周围出现胶原纤维细丝，与成纤维细胞紧密相连(应为新生的胶原纤维)，新生纤维束排列规则，束间无架桥(见图5)，原有胶原纤维束的排列改变不明显(见图6)。

4 讨论

4．1 围刺对老化皮肤胶原含量的影响

机体的自然老化又称时程老化、固有性老化，主要由遗传因素决定，是与机体衰老同步的生理现象，在皮肤主要表现为皮肤全层及其附属器官的萎缩及功能减退等，具体表现为：①皱纹细微、无斑点、血

管突显；②表皮中郎格罕细胞(LC)的密度降低，且其树枝状突起分枝减少，提示免疫力降低；③表皮和真皮连接处变平；④真皮萎缩，血管供应减少，皮肤中脂褐素的含量有规律地随年龄递增；⑤成纤维细胞数目减少、活性降低，胶原蛋白多肽链间的共价交联程度增加，电镜下弹性纤维变细、排列紊乱，偶见纤维断裂，纤维内微丝减少，电子密度高的内含物增加。据本实验推测，围刺针法对老化皮肤胶原的作用主要是通过以下途径实现的：

(1)促使局部神经递质的释放

由于针灸能够促使皮肤局部组胺和乙酰胆碱等神经递质释放，刺激血管扩张，促进血液循环、淋巴循环，改善浅表血管和神经的营养状态，因此皮肤供养相对充分，胶原合成增加，局部皮肤张力增强，皱纹变浅，老化的外观能够得以改善。

(2)消除细胞间的“接触性抑制”

胶原纤维占皮肤干重的90％，由胶原蛋白分子以共价键交联而成，主要具有支持功能，构成了真皮结缔组织的几乎整个固态成分，决定着真皮的机械张力，胶原蛋白合成与多种酶的活性于儿童早期最高，之后逐渐降低。胶原纤维之间的共价交联分为未成熟性架桥、成熟性架桥、老化性架桥3种。在时程老化的过程中，非暴露部位的皮肤因老化性架桥逐渐增多而使胶原代谢率降低，表现为胶原纤维的弱酸溶解度下降，即可溶性胶原(新合成者)减少。对于不溶性胶原纤维的含量与年龄的关系，不同的学者提出了不同的观点：有的资料表明胶原纤维的总量随着增龄而减少，有的学者则发现时程老化引起不溶性胶原蛋白的增加，皮肤的总胶原蛋白含量(可溶性与不溶性胶原蛋白总量)增加，而可溶性胶原含量的减少是使皮肤表面呈现皱纹的重要原因。本实验结果与后者相符，说明局部围刺可以增加真皮可溶性胶原的含量。

本实验中围刺刺入皮肤的真皮下、筋膜上，其位置恰好邻近真皮网状层，由于在皮下造成了针刺的微小创口而消除了细胞间的“接触性抑制”，促使真皮网状层中胶原纤维增生修复，使皮肤成纤维细胞的活性增强，从而促使更多胶原纤维的合成，对抗了皮肤老化过程中可溶性胶原纤维进行性减少的过程，从而增强皮肤的张力，与老化过程中胶原的合成障碍是一个相互拮抗的过程，因此可以从一定程度上延迟或对抗皮肤皱纹的产生。

4．3 围刺法除皱的适应症

国外一些学者根据皱纹深浅和皮肤老化程度将皱纹分成3度：工度为皮肤的轻度损伤，面部肌肉活动时可见浅细皱纹；Ⅱ度为皮肤的中度损伤和老化，面部活动静止时仍可见皱纹，但牵拉皮肤时消失；Ⅲ度表现为皮肤深粗的皱纹，牵拉时也不消失。对于皮肤组织发生了不可逆严重损伤的Ⅲ度皱纹，同时合并筋膜肌肉松弛，只有通过整形手术切除多余的皮肤，悬吊松弛的筋膜和骨膜，才能使皮肤的外观得以改善，工一Ⅱ度皮肤损伤因年龄多在30～40岁，皮肤已经发生部分不可逆性损伤，药物治疗不能达到满意的效果，但又不适宜行面部皮肤上提术。

因此，国内有学者根据植皮后不产生皱纹的原理，进行真皮下分离和切割，以增加真皮组织中胶原蛋白的含量，修复断裂的胶原。手术后可见术区皮肤面积明显缩小，但鼠毛部分脱落，这是手术除皱的弊端之一。由于皮下切割术由手术刀制造创面，损伤相对较大，操作不当或正常操作也很难避免造成毛囊、汗腺、皮脂腺的损伤，并且术后需要加压包扎，护理较为复杂。而用针灸针围刺的方法制造皮下创面，则有皮肤损伤小、操作简便、患者易于接受的优点，因此是一种较理想的除皱方法。同时，由于创面小，也决定本法只适合于皮肤的工一Ⅱ度损伤、皱纹比较浅小的皮肤。