一点红不同营养器官中鞣质和绿原酸含量测定

摘 要:目的:建立一点红不同营养器官中鞣质和绿原酸含量测定方法。方法:以没食子酸为对照品,采用磷钼钨酸-干酪素比色法测定了鞣质含量;以绿原酸为对照品,采用高效液相色谱法测定了绿原酸含量。结果:没食子酸浓度在2～10mg•L-1范围内,与吸光度呈良好线性关系,平均加样回收率为100.32%,RSD=1.45%,一点红叶、茎、根中鞣质含量分别为0.25%、0.15%、0.22%;绿原酸含量在0.0356～0.5340μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系,平均加样回收率为99.37%,RSD=1.52%,一点红叶、茎、根中绿原酸含量分别为1.28%、1.14%、0.91%。结论:这两种方法灵敏,准确性强,精密度高,重复性好,适用于一点红中鞣质和绿原酸含量的测定。

关键词:一点红;鞣质;绿原酸;含量测定

中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0125-03

Determination of Tannins and Chlorogenic Acid of Different Vegetative Organs in Emilia sonchifolia (Linn.)DC

ZHANG Yan, ZHANG Hongbin, CHEN Guangzhou,WANG Yan

(Department of Life and Science, Qiongzhou College, Wuzhishan 572200,Hainan, China)

Abstract:Objective: To establish the analytical methods for determinating the contents of tannins and chlorogenic acid of different vegetative organs in Emilia sonchifolia (Linn.)DC. Methods: The content of tannins, expressed as gallic acid equivalents, was measured by using the phospho molybdenum tungstic acid-casein colorimetry, and the content of chlorogenic acid, expressed as chlorogenic acid equivalents, was measured by HPLC. Results: The good linearity between concentrations and absorbances of gallic acid was found in the range of 2～10 mg L-1, the average recovery was 100.32% and RSD was 1.45%, the contents of tannins in leaves, stems and roots of Emilia sonchifolia (Linn.)DC were 0.25%,0.15% and 0.22% respectively; The good linearity between content and peak area integral value of chlorogenic acid was found in the range of 0.0356~0.5340μg, the average recovery was 99.37% and RSD was 1.52%, the contents of chlorogenic acid in leaves, stems and roots of Emilia sonchifolia (Linn.)DC were 1.28%,1.14% and 0.91% respectively. Conclusion: Two proposed methods are sensitive, precise, accurate and reproducible, and they are suitable for the determination of tannins and chlorogenic acid in Emilia sonchifolia (Linn.)DC.

Key words:Emilia sonchifolia (Linn.)DC; tannins; chlorogenic acid; determination

一点红[Emilia sonchifolia (Linn.)DC][1],为菊科一点红属植物,一年生或多年生草本,又名叶下红、羊蹄草、红背叶、山羊草、野芥兰、牛尾膝等,在我国南方各省均有分布。一点红全草入药[2],清热凉血,活血化瘀,利尿消肿,消炎解毒。主治上呼吸道感染、咽喉肿痛、口腔溃疡、肺炎、急性肠炎、细菌性痢疾、泌尿系统感染、炎、乳腺炎、疖肿疮疡、皮肤湿疹、跌打扭伤。它还是目前市场上畅销的妇科良药――花红冲剂的主要原料。近些年来,一点红又成为人们喜爱的一种野菜[3],食味柔滑,口感清爽。

目前对一点红的研究主要集中在部分化学成分、栽培技术等方面[4-7],对其次生代谢产物含量的研究较少。本文对一点红不同营养器官中鞣质和绿原酸含量进行了测定分析,为一点红的药用质量控制及其次生代谢产物的进一步研究和开发提供参考依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

一点红采自海南五指山市郊(由本系林教授鉴定为一点红全草),将其洗净,分成根、茎、叶三部分,在40℃条件下烘干至恒重,粉碎,过40目筛,放在干燥器中备用。

1.2 主要仪器LC-2010c型高效液相色谱仪(LCSOLUTION工作站,日本岛津公司);BP211D电子天平(德国Sartorius公司);UV-2100双光束紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);CO250型超声波清洗器(上海超声仪器厂)。

1.3 试剂没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110831-200302);绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110753-200413);磷钼钨酸试液(按《中华人民共和国药典》2005年版一部附录ⅩⅤB配制)[8];乙腈为色谱纯;水为二次蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鞣质含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品50mg,置100mL棕色量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,精密量取5mL,置50mL棕色量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得0.05 mg•mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精确称取一点红的根、茎、叶粉末各2g,分别置250mL棕色量瓶中,加水150mL,放置过夜,超声处理10min,放冷,用水稀释至刻度,静置,滤过,弃去初滤液50mL,精密量取续滤液20mL,置100mL棕色量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即得。

2.1.3 标准曲线的制备 精密量取没食子酸对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置25mL棕色量瓶中,各加入磷钼钨酸试液1mL,再分别加水11、10、9、8、7mL用29%碳酸钠溶液稀释至刻度,摇匀。以随行试剂为空白。将对照品溶液在400~900nm波长范围内进行光谱扫描,确定最大吸收波长为760nm。30min后,于760nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。计算得回归方程为: Y=0.0909X +0.0519,r=0. 9999,结果表明,没食子酸浓度在2～10mg•L-1 的范围内,与吸光度有良好的线性关系。

2.1.4 含量测定方法 总酚:精密量取供试品溶液2mL,置25mL棕色量瓶中,照2.1.3项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液1mL”起,加水10mL,依法测定吸光度,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg),计算即得。

不被吸附的多酚:精密量取供试品溶液25mL,加至已盛有干酪素0.6g的100mL具塞锥形瓶中,密塞,置30℃水浴中保温1h,时时振摇,取出,放冷,摇匀,过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液2mL,置25mL棕色量瓶中,照2.1.3项下的方法,自上述“加入磷钼钨酸试液1mL”起,加水10mL,依法测定吸光度,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg),计算即得。

按下式计算鞣质的含量:鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量

2.1.5 精密度试验 精确吸取对照品溶液2mL置25mL棕色量瓶中,照2.1.3项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液1mL”起,加水10mL,依法测定吸光度,重复测定5次,吸光度的RSD=0.36%,表明精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精确称取同一供试品粉末5份,各2g,按照2.1.2项下方法制成供试品溶液,再按照2.1.4项下方法测定吸光度,测得总酚吸光度的RSD=2.13%,不被吸附的多酚吸光度的RSD=1.86%,表明重现性良好。

2.1.7 稳定性试验 取显色后的同一供试品溶液,分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h测定吸光度,结果供试品溶液在显色0.5h后至3h内吸光度稳定,吸光度的RSD=1.74%。表明供试品溶液应在显色0.5h后开始测定,并在3h内测定完毕。

2.1.8 回收率试验 取已知鞣质含量的同一样品5份,分别精密添加一定量的没食子酸对照品,按供试液的制备及2.1.4项下操作,依法测定,并计算回收率。结果见表1。

2.1.9 样品含量测定 精确称取一点红的根、茎、叶粉末各2g,按照2.1.2下制成供试品溶液,再按照2.1.4下测定吸光度,根据回归方程求出样液中鞣质的含量,再计算出样品中鞣质的含量。结果见表2。

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱: Agilent Zorbax-C18(250mm×4.6mm, 5μm);流动相:乙腈-0.4%磷酸(11∶89);流速1.0mL•min-1,理论塔板数以绿原酸计算大于3000。外标法定量,进样量20μL,检测波长:327nm,柱温25℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品3.56mg,置10mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,即得浓度为0.356mg•mL-1的对照品贮备液;准确吸取1.0mL此贮备液,置10mL棕色量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀即得浓度为0.0356mg•mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精确称取一点红的根、茎、叶粉末各1.0g,分别加50%甲醇50mL,称定重量,超声处理30min,放冷。用50%甲醇补充减失的重量,取续滤液5mL置10mL棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得。

2.2.4 系统适应性试验 按上述色谱条件,分别吸取对照品溶液及叶供试品溶液各10μL注入液相色谱仪,记录色谱图。结果,绿原酸峰与其它组分峰能够达到基线分离,对照品及供试品溶液中绿原酸峰的保留时间一致。色谱见图1。

2.2.5 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液1、3、5、7、9、11、13、15μL,进样,按上述色谱条件进行分析,测定峰面积。以进样量(X,μg)对峰面积积分值(Y)进行线性回归,得回归方程为Y=2.1952×106X-25679,r=0.9999。结果表明,绿原酸进样量在0.0356～0.534 0μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液20μL,按上述色谱条件重复进样5次,测定峰面积。结果,RSD=0.27%,表明仪器精密度良好。

2.2.7 重现性试验 精确称取同一供试品粉末5份,各1g,按2.2.3制备供试品溶液,进样量20μL,测定峰面积的RSD=1.94%。说明本方法重现性良好。

2.2.8 稳定性试验 对同一供试品溶液分别于制备后0、1、2、4、6、8、10h测定绿原酸峰面积。结果,峰面积RSD=2.06%,表明供试溶液在10h内具有良好的稳定性。

2.2.9 回收率试验 精确称取已知含量的同一样品5份,分别准确加入近等量的绿原酸对照品,按2.2.3下制备供试品溶液,按上述色谱条件测定含量,计算加样回收率,结果见表3。

2.2.10 样品含量测定 精确称取一点红的根、茎、叶粉末各1.0g,按照2.2.3制成供试品溶液,根据上述色谱条件进行测定,根据回归方程求出样液中绿原酸的含量,再计算出样品中绿原酸的含量。结果见表4。

3 讨 论

以没食子酸为对照品,通过磷钼钨酸-干酪素比色法,采用紫外可见分光光度计在760 nm波长处测定了一点红不同营养器官中鞣质的含量,由表2可知,鞣质含量在一点红叶中最高为0.25%,其次是根为0.22%,茎中最低为0.15%。通过实验发现该方法在测定鞣质时,为了保证测定结果的准确,应采用现用现配的方式且应在避光的方式下进行测定。

以绿原酸为对照品,采用高效液相色谱法测定了一点红不同营养器官中绿原酸的含量,由表4可知,绿原酸含量在一点红叶中最高为1.28%,其次是茎为1.14%,根中最低为0.91%。本实验对流动相进行了比较,用不同比例的甲醇-3%醋酸水溶液、甲醇-乙腈、乙腈-0.4%磷酸溶液进行试验。结果,以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)分离效果最佳,保留时间适宜,故选用其作为流动相。取绿原酸对照品溶液,以50%甲醇为空白,在200～400nm波长范围内扫描。结果,绿原酸在327nm波长处有最大吸收,故选择327nm为检测波长。

上述可知,在一点红不同营养器官中鞣质、绿原酸含量具有显著的差异性。

实验结果表明,这两种方法都具有操作简便,效率高,精密度高,稳定性和重现性好,测定结果可靠的优点,适用于一点红中鞣质、绿原酸的定量分析。可为一点红药用质量评价提供可靠的检测标准。

参考文献

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[2] 戴义龙.常用草药图集 [M].福州:福建科学技术出版社,2007:5-6.

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