分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的克伦特罗

摘 要 以盐酸克伦特罗为模板分子，采用沉淀聚合法合成了克伦特罗的分子印迹聚合物，并以其为离子载体，制得分子印迹聚合物膜克伦特罗离子选择性电极。在最优实验条件下，电极对克伦特罗阳离子的检出限可达7.0 × 10

Symbolm@@ 8 mol/L，线性范围为1.0 × 10

Symbolm@@ 7～1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L，能斯特斜率为55.7 mV/decade。此电极具有优越的选择性、快速的响应时间以及良好的稳定性；已成功应用于实际猪尿样品中克伦特罗的测定，加标回收率为98%～107%，检测时间小于3 min。

关键词 分子印迹聚合物； 电位型传感器； 克伦特罗

2011-08-10收稿；2011-09-22接受

本文系国家自然科学基金（No. 20977073）、山东省自然科学杰出青年基金（No.JQ200814）以及山东省“泰山学者”人才计划项目资助

* E-mail: wqin@yic.省略

1 引 言

“瘦肉精”的主要化学成分包括克伦特罗、莱克多巴胺以及沙丁醇胺等，其中在中国使用最广泛的是克伦特罗。克伦特罗是一种肾上腺素类神经兴奋剂，早期仅用于医学急救和肺病平喘；后来发现，将其作为饲料添加剂用于畜牧生产时，可以提高动物瘦肉率。然而，克伦特罗使用后会在动物体组织中残留，人食用后会对肝、肾等内脏器官造成损害，严重者甚至会死亡[1]。2011年，我国相继发生的“瘦肉精”事件，引起了人们对克伦特罗的高度关注，因此开发生物样品中克伦特罗检测方法具有重要意义。

目前，检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[2]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[3]、金标快速检测卡、免疫层析［4］和酶联免疫法（ELISA）[5]等。然而，HPLC和GC-MS法存在仪器成本高，分析速度慢等缺点；金标快速检测卡法的假阳性率高，干扰因素较多；ELISA法多用于定性检测，难以进行准确定量。化学传感器因其具有操作简单、携带方便、易于现场监测等优越性能而备受关注。聚合物敏感膜离子选择性电极是化学传感器的重要分支，它具有装置简单、成本低廉、选择性高等诸多优点，已成功应用于工业分析、临床化验、环境监测等领域[6～8]。然而，采用离子选择性电极电位法检测克伦特罗的研究还未见报道。

分子印迹聚合物（MIPs）是通过分子印迹技术合成对目标分子具有特异性识别功能的聚合物[9，10]。MIPs能够显著提高分析方法的选择性和灵敏度，且MIPs具有较强的稳定性, 可以抵抗检测的恶劣环境。因此MIPs是离子选择性膜电极在复杂基体中实现可靠检测的理想离子载体。本研究以克伦特罗分子印迹聚合物作为离子载体，采用离子选择性电极法，实现了猪尿液中克伦特罗的快速、高灵敏、高选择性电位检测。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

PXSJ-216离子计（上海精科公司）；DU-800紫外/可见光分光光度计（美国Beckman公司）；S-4800冷场发射扫描电镜（日本日立公司）。

盐酸克伦特罗标准品（中国食品药品检定研究院）；甲基丙烯酸（MAA）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙烯酸三甲氧基丙烷三甲酯（TRIM）、二乙烯基苯80（DVB 80）、高分子量聚氯乙烯（PVC）、邻硝基苯辛醚（o-NPOE）、四（3,5-二（三氟甲基）苯基）硼酸钠（NaTFPB）、四氢呋喃（THF）及盐酸莱克多巴胺（Sigma-Aldrich公司）；偶氮二异丁腈（AIBN，天津科密欧化学试剂有限公司）。MAA、TRIM、DVB 80以及THF使用前须真空蒸馏，AIBN使用前经甲醇重结晶，其余试剂均为分析纯试剂直接使用。实验用水均为二次去离子水（Pall Cascada，18.2 MΩ cm）。0.1 mmol/L克伦特罗（pKa＝9.6）溶液采用5 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.4）配制，以保证克伦特罗以阳离子形式存在；其余浓度均采用缓冲溶液逐级稀释得到。

2.2 克伦特罗分子印迹聚合物的合成

采用沉淀聚合法合成克伦特罗分子印迹聚合物[11]，具体合成步骤如下：取0.4 mmol盐酸克伦特罗、2.5 mmol MAA和0.83 mmol MMA，溶于40 mL甲醇中，静置1 h。将1 mmol TRIM和0.4 mmol DVB及0.5 mmol AIBN加入到上述混合物中，通氮气10 min。将上述反应容器在氮气氛围下密封，于70 ℃下反应24 h，得到白色固体颗粒。将所得白色固体颗粒分别采用甲醇-乙酸溶液（9∶1，V/V）及甲醇多次洗涤，直至洗脱液于紫外光谱下λ＝245 nm处无吸收峰为止。非分子印迹聚合物（NIP）的制备步骤除不加入盐酸克伦特罗外，其余均与分子印迹的制备过程相同。模板克伦特罗分子以及功能单体MAA与MMA的分子结构式如下所示：

2.3 分子印迹聚合物膜离子选择性电极的制备

电极膜由分子印迹聚合物（MIP）或非分子印迹聚合物（NIP）、亲脂性的阳离子交换剂（NaTFPB）、增塑剂（o-NPOE）和膜基体（PVC）组成。取5.0% （w/w）MIP或NIP、1.0% （w/w）NaTFPB 、62.6% （w/w） o-NPOE及31.4% （w/w） PVC，共360.0 mg，溶于3.5 mL THF中，得到电活性物质溶液。搅拌2 h至溶液均匀后，倒入直径为3.6 cm的玻璃圆环中，室温下自然挥发12 h，即得分子印迹聚合物敏感膜。利用打孔器将敏感膜切割成直径9 mm的均匀圆形切片，采用THF将敏感膜粘附于聚氯乙烯管顶端。测定电极对克伦特罗的电位响应时，电极内充液和活化液均为1.0 ×10

Symbolm@@ 4 mol/L克伦特罗溶液（5 mmol/L Tris-HCl溶液，pH 7.4），使用前活化24 h。测定选择性系数时，电极内充液和活化液均为0.01 mol/L NaCl，使用前活化24 h。

2.4 检测方法

以自制分子印迹电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，采用PXSJ-216离子计记录电极电位。其中，测试电池的结构为：Hg2Cl2, Hg|KCl（饱和溶液）|待测液|PVC敏感膜|内充液|Ag, AgCl （3 mol/L KCl）。采用Henderson公式和Debye-Hückel方程分别对液接电位及活度系数进行校正。

3 结果与讨论

3.1 MIP与NIP形貌表征

采用扫描电镜对所合成的克伦特罗MIP与NIP颗粒进行了形貌表征。如图1a所示，沉淀聚合所得

图1 克伦特罗分子印迹聚合物以及非印迹聚合物颗粒的扫描电镜图

Fig．1 SEM images of obtained （a） clenbuterol-MIP and （b） NIP beads

到的MIP颗粒粒径较规整均一，粒径多分布在0.5～1.0

SymbolmA@ m之间。根据本研究组已报道的研究结果[12]可知，与主体聚合所得到的不规则粒径颗粒相比，粒径均一的MIP颗粒较易分散于PVC基体的聚合物膜相中，从而使得膜相中产生更多的有效键合位点。本研究发现，采用粒径均一的MIP颗粒作为载体的电极响应时间较短，且电位噪音较小。由图1b可知，NIP与MIP颗粒具有类似的表观形貌与粒径分布。

3.2 电极膜组成优化

聚合物膜组成对电极响应性能有重要影响。本实验的离子选择性电极膜组分包括MIP、NaTFPB、增塑剂及PVC。其中，MIP是离子载体。MIP上的功能单体MAA和MMA中的氧基可与克伦特罗分子中的氨基形成较强的氢键作用，选择性地识别克伦特罗阳离子，并将其萃取入有机膜相；NaTFPB作为阳离子交换剂，不仅可以提供阳离子位点及提高电极的选择性，而且有利于降低电极膜阻抗；增塑剂可以将离子载体与离子位点均匀溶解于膜中，并促进膜内离子的迁移；PVC构成膜的基体部分，保证有机液膜具有良好的机械稳定性。如表1所示，离子交换剂含量对电极响应性能有较大影响。随着离子交换剂含量增加， 电极能斯特响应范围逐渐变宽，但当其含量超过1%时，电极响应范围变窄，推测可能为离子交换剂量越大，膜上阳离子位点越多，导致膜对干扰离子选择性降低。离子载体MIP的含量决定了电极膜上选择性键合位点的数量，伴随着MIP的加入，电位线性响应范围逐渐变宽；然而，当MIP的量大于5%时，MIP在膜相中难以完全分散，膜变得不透明，导致电极响应性能降低。另外，极性增塑剂o-NPOE（介电常数εr＝24.0）与非极性增塑剂DOS（εr＝4.8）或DOP（εr＝5.0）相比，相应电极具有更宽的线性响应范围。这可能是由于在极性条件下，电极对于克伦特罗阳离子具有更高的选择性。本实验中，膜电极的最佳组成为31.3%（w/w）PVC，62.7%（w/w）NPOE，1%（w/w）NaTFPB，5% （w/w）MIP。

51.7±0.5 .a 3次测量平均值 ±标准偏差 （Average from three measurements ±standard deviation）\.NPOE: Nierophenyl octyl ether ; DOP: Dioctyl phthalate; NaTFPB: Sodiom tetrakis ［3,5-bis（trifluoro-methyl）phenyl］borate.

Fig．2 Effect of sample pH on the electrode response of 0.1 mmol/L clenbuterol

3.3 溶液pH值的影响

在pH 1～11范围内，考察了样品酸度对电极电位检测的影响，结果如图2所示。在pH 7.0～8.5范围内，电极电位响应基本恒定。当pH＞8.5时，电极电位逐渐下降，这是因为随着溶液pH值升高，克伦特罗将逐渐以电中性分子形式存在，而无法被离子选择性电极所检测；当pH＜7.0时，电极电位响应逐渐降低，其原因可能是克伦特罗在酸性条件下发生水解反应，导致其浓度减小[13]。

3.4 电极校正曲线

如图3所示，在最佳电极膜组成条件下, MIP膜电极响应的线性范围

Symbolm@@ 8 mol/L。可以看出，MIP膜电极与对照（NIP）膜电极以及空白膜（不含任何印迹聚合物）电极相比线性响应范围更宽、检出限更低。MIP膜电极良好的电位响应归因于电极敏感膜中的MIP与待测克伦特罗阳离子之间的强特异性键合作用，而NIP膜电极以及空白膜电极的弱电位响应缘于电极膜对于克伦特罗阳离子的非特异性结合作用。

3.5 选择性研究

由于动物尿液样品组成复杂，需要考虑共存离子对于电极检测的影响。研究中采用分别溶液法测定电极的选择性系数[14]，由Nicolskii-Eisenman方程计算电极对干扰离子的选择性系数KpotI,J [15]。如表2所示，所采用的分子印迹聚合物膜离子选择性电极对实际样品中常见无机干扰离子及有机胺类化合物具有良好的选择性，其中对Na.＋, K.＋, Ca2＋, Mg2＋, NH.＋4及莱克多巴胺阳离子的选择性系数logKpotI, J分别为

由此证明，所采用的电极适用于动物尿液中克伦特罗的电位测定。另外，分子印迹膜电极对常见的

.a 括号中为NIP膜电极的选择性系数 （Values in parentheses are the selectivity coefficients for NIP membrane electrode）。

Na.＋, K.＋的选择性比非分子印迹对照膜电极更加优越，从而进一步证明了分子印迹方法的有效性。

3.6 电极响应时间与稳定性

测定了电极检测克伦特罗的响应时间（达95%平衡电位的时间），结果如图4所示。当克伦特罗浓度在1×10

Symbolm@@ 5～1×10

Symbolm@@ 4 mol/L之间变化时，电极响应时间小于5 s。待测的克伦特罗溶液的浓度无论从低到高（1×10

Symbolm@@ 5～1×10

Symbolm@@ 4 mol/L）变化，还是从高到低（1×10

Symbolm@@ 4～1×10

Symbolm@@ 5 mol/L）变化，电极电位响应均能在相同的时间内达到相应的平衡电位值，从而证明所研制的传感器具有良好的可逆性。通过对电极长期稳定性考察发现， 电极干态放置于4 ℃ 条件下储存1个月后，电位响应变化的相对偏差为6.4%。

3.7 实际样品分析

将分子印迹聚合物膜离子选择性电极应用于猪尿样品中克伦特罗含量的测定，采用标准加入法计算经0.22

SymbolmA@ m微孔滤膜过滤的猪尿样品，测试结果见表3。样品的加标回收率在98%～107%之间，说明此分子印迹电位型传感器具有较高的准确性；另外，猪尿样品仅经简单过滤而直接测定且电极响应时间较短，总检测时间在3 min内。因此，本方法有望用于猪尿液样品中克伦特罗含量的快速、准确检测。

图4 分子印迹聚合物膜电极响应时间测定

Fig．4 Potential response of the MIP based ISE

References

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Potentiometric Sensor Based on Molecularly Imprinted Polymer for

Rapid Determination of Clenbuterol in Pig Urine

LIANG Rong-Ning.1, GAO Qi1,2, QIN Wei*1

.1（Chinese Academy of Sciences and Shandong Provincial Key Laboratory of Coastal Zone Environmental Processes,

Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China）

.2（Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Abstract A polymeric membrane ion-selective electrode for the determination of clenbuterol is described. It is based on a molecularly imprinted polymer （MIP） as an ionophore for molecular recognition, which can be synthesized by precipitation polymerization using clenbuterol hydrochloride as a template molecule. Under the optimized conditions, the proposed membrane electrode exhibits Nernstian response to the protonated clenbuterol over the concentration range of 1.0×10

Symbolm@@ 7－1.0×10

Symbolm@@ 4 mol/L with a slope of 55.7 mV/decade, and the detection limit is 7.0×10

Symbolm@@ 8 mol/L. The MIP-based sensor shows excellent selectivity, rapid response time and satisfactory long-term stability. The potentiometric sensor has been successfully applied to determine the clenbuterol in pig urine samples with recoveries between 98% and 107% and an analytical time of less than 3 min.

Keywords Molecularly imprinted polymer; Potentiometric sensor; Clenbuterol

（Received 10 August 2011; accepted 22 September 2011）