腹水脱落细胞hTERT mRNA的表达状况及其意义

【摘 要】目的：以腹水脱落细胞为标本，采用原位杂交的方法检测hTERT mRNA，从RNA水平研究腹水的hTERT mRNA表达状况，探讨其对恶性腹水的诊断价值。方法：90例患者腹水提取脱落细胞，巴氏染色将标本分为良性体腔积液与恶性体腔积液以及可疑体腔积液三组，并对脱落细胞进行hTERT mRNA的原位杂交，DAB显色，判断结果。结果：恶性积液组hTERT mRNA阳性表达率为87.5%，可疑恶性组为72.7%，良性组为25.6%，三组比较有统计学意义。结论：原位杂交检测腹水脱落细胞hTERT mRNA对诊断恶性腹水有良好的敏感性，而且采用核酸原位杂交技术检测hTERT mRNA，不仅具有分子杂交的特异性好、灵敏度高的特点，还兼备细胞化学染色的可见性和定位性优点。

【关键词】腹水；脱落细胞；核酸原位杂交；HTERTmRNA＼

【中图分类号】R450 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2012）12-0004-02

腹水是一种常见的临床病症。按病因不同，可分为良性与恶性，恶性积液约占25%～30%。两种不同性质积液的鉴别，对于确定治疗原则和判断患者的预后具有重要的临床价值。良恶性腹水的鉴别主要依据实验室检测结果，但目前常用的实验室诊断方法尚难以满意解决良恶性积液之间的鉴别诊断。因此，寻找新的方法与技术以解决良恶性积液的鉴别诊断具有重要的临床意义。

端粒酶是近年来发现与细胞癌变密切相关的一种生物分子，90%以上的恶性肿瘤细胞有端粒酶表达，而正常体细胞无表达，因而被认为是肿瘤发生发展的“通用”分子机制。端粒酶主要由3部分组成，即端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP1）和端粒酶逆转录酶（hTERT）。hTR是端粒DNA合成的模板，hTERT是端粒酶活性的基础，TP1的功能尚不清楚。hTR和TP1在肿瘤及正常细胞中均持续表达，并无差异，而hTERT只表达于端粒酶阳性细胞，并且是端粒酶的限速因子，其mRNA表达水平直接决定端粒酶的活性程度。正常体细胞缺乏端粒酶活性正是因为不表达hTERT mRNA，而肿瘤细胞和永生化细胞存在端粒酶活性也正是表达hTERT mRNA，也就是说，hTERT是端粒酶的核心。

各种恶性肿瘤可发生浆膜转移，引起恶性腹水。检测积液脱落细胞的hTERT mRNA及其表达情况，可能对恶性积液的诊断以及与良性积液的鉴别具有重要的临床价值。为此，本研究以腹水脱落细胞为标本，采用原位杂交的方法检测hTERT mRNA，从RNA水平研究腹水的hTERT mRNA表达状况，探讨其对恶性腹水的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 对象：94例腹水标本来自94例不同患者，其中腹水51例，胸水41例，心包积液2例。详细查阅病例的病案资料，所有病例均根据细胞学、病理学和（或）CT/B超等检查确定临床诊断。结合脱落细胞巴氏（Papanicolaou）染色结果及病理科提供的细胞学诊断结果确定标本的诊断，并据此将标本分为良性体腔积液与恶性体腔积液以及可疑体腔积液三组。

1.2 方法

1.2.1 标本的处理：离心提取腹水中的脱落细胞，图片后进行巴氏染色[1，2]，光镜下判读结果。间皮细胞多呈圆形，规则，胞核圆形或卵圆形，居中或偏心，胞浆呈浅蓝色，多为细颗粒状。肿瘤细胞形态多不规则，常大小不等，可成团，胞核大而深染，多不规则，大小不一，核浆比例失调。找到肿瘤细胞判为恶性积液，找到细胞异型性比较明显但不足以诊断为肿瘤细胞为可疑恶性积液，否则判为良性积液。

1.2.2 脱落细胞hTERT mRNA的原位杂交分析

1） 按试剂盒说明书进行。原位杂交探针针对hTERT mRNA的序列为：

5’―GCCGC TGGCC ACGTT CGTGC GGCGC CTGGG―3’

5’―TTCTA CCGGA AGAGT GTCTG GAGCA AGTTG―3’

5’―CGGCG ACATG GAGAA CAAGC TGTTT GCGGG―3’

探针采用地高辛标记，酶系统为链霉卵白素-过氧化物酶，DAB显色，原位杂交专用PBS代替探针作为阴性对照。具体操作步骤按说明书进行。

2） 结果判断

a、阳性细胞的判断：hTERT mRNA原位杂交DAB显色呈棕黄色颗粒样着色，以胞浆明显，也见于胞核，少见于胞膜。将染色状况分为Ⅳ级：Ⅰ级无着色，Ⅱ级为浅黄色，Ⅲ级为黄色，Ⅳ级为棕黄色。Ⅰ、Ⅱ级计为阴性，Ⅲ、Ⅳ级计为阳性。

b、阳性标本的判断：高倍视野下，计数100个良性细胞和/或癌细胞，计算出阳性细胞百分比。阳性细胞≥80%计为强阳性（+++），20%～79%计为阳性（++），10%～19%计为弱阳性（+），0～9%计为阴性（）。（+）～（+++）均计为阳性标本，（）计为阴性标本。

1.3 统计学处理

计数资料采用卡方检验，等级资料采用秩和检验，p

2 结果

2.1 临床资料

94例腹水的患者中，男46例，女48例，年龄18～85岁，平均53.4岁。细胞学检查诊断为恶性腹水者40例，良性腹水43例，可疑恶性积液11例。各病例的临床诊断详见表1。

3 讨论

腹水是由多种疾病引起的临床常见病症，其良恶性质的鉴别直接关系诊断、治疗及预后判断。积液良恶性质的鉴别常为临床上的难题。

端粒是指位于真核细胞线性染色体末端的一种白复合体，由富含G的DNA重复序列和端粒结合蛋白构成。人类端粒长度为15Kb左右，细胞每分裂一次约缩短50～200个核苷酸。随着细胞分裂次数的增加，端粒进行性缩短，缩短到一定程度后则失去其稳定染色体的功能，细胞因而发生增殖性衰老，最终死亡[3]。端粒酶正是这样一种能合成端粒重复序列以维持端粒长度的核糖白酶，能使细胞避免增殖性衰老而永生化。端粒酶具有逆转录酶活性，能以自身RNA为模板合成端粒重复序列，弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失。

端粒酶主要由3部分组成：端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP1）和端粒酶逆转录酶（hTERT）。hTERT以hTR为模板进行逆转录合成端粒重复序列来延长端粒。TP1和hTR在肿瘤及正常细胞中均持续表达，并无差异[4]。hTERT是端粒酶活性的基础，只表达于端粒酶阳性细胞，并且是端粒酶的限速因子，其mRNA表达水平直接决定端粒酶的活性程度[5]。

研究表明，人类正常体细胞无端粒酶活性，而85%～90%的恶性肿瘤可检出端粒酶活性。人类细胞在胚胎发育早期，端粒酶呈活化状态，随后被抑制并一直处于失活状态，因而体细胞无端粒酶活性。当体细胞发生癌变时端粒酶再度活化，以逃避正常的细胞衰老过程，获得无限增殖的潜能。因此，端粒酶再活化是恶性肿瘤一个显著的生物学特征。本研究采用原位杂交技术检测腹水脱落细胞hTERT mRNA，诊断恶性积液的敏感性达到87.5%，高于Dejmek等[6]采用原位TRAP检测恶性胸水中肿瘤细胞端粒酶活性的阳性率（67%），而与Hiroi等[7]采用原位杂交技术检测腹水脱落细胞hTERT mRNA的阳性率（90%）相似，提示原位杂交检测腹水脱落细胞hTERT mRNA对诊断恶性腹水有良好的敏感性，而且采用核酸原位杂交技术检测hTERT mRNA，不仅具有分子杂交的特异性好、灵敏度高的特点，还兼备细胞化学染色的可见性和定位性优点。结合细胞形态学信息判断端粒酶的表达状态，显然是良好的选择。

参考文献：

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[5] Rhyu MS. Telomeres， telomerase and immortality. JNCI， 1995，87：884-894.

[6] Dejmek A， Yahata N， Ohyashiki K， et al. In situ telomerase activity in pleural effusions： a promising marker for malignancy. Diagn Cytopathol， 2001， 24（1）：11-15.

[7] Hiroi S， Nakanishi K， Kawai T. Expressions of human telomerase mRNA component （hTERC） and telomerase reverse transcriptase （hTERT） mRNA in effusion cytology. Diagn Cytopathol， 2003， 29（4）：212-216.