禽流感病毒诊断技术研究进展

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的危及禽类、小型哺乳动物和人类的以呼吸道症状为主，甚至全身性败血症的一种病毒性传染病。就近年来AlV实验室检测技术的研究进展作一综述。

禽流感诊断技术

1病毒的分离培养

禽流感通常从人类感染者的结膜拭子、呼吸道样品（如咽喉或鼻分泌物和冲洗物）中分离到，无菌采集病料，经处理后接种9～11日龄鸡胚。因AIV的HA能使璃红细胞发生凝集，可用血凝实验作病毒的初步鉴定。若尿囊液为阴性则应继续盲传2～3代。对阳性尿囊液需先用新城疫（ND）抗血清做血凝抑制（HL）试验，以排除ND感染。然后用免疫扩散等方法来检测特异性核心抗原一核糖蛋白（NP）或基质蛋白（MP），再用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴定A型流感病毒亚型。鸡胚分离培养的特异性和敏感度均可以达到100%，但操作繁琐，耗时较长，需要一周左右时间。

2琼脂凝胶扩散试验（AGP）

抗原抗体在琼脂中由高浓度向低浓度自由扩散可以形成特异性肉眼可见的沉淀线。此法能用于检测AIV共同抗原NP或MP。由于所有的AIV都具有型特异性共同抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV的抗体或抗原进行鉴定。1970年Beard首次将AGP用于禽流感抗体的检测，此法虽然简便易行，但敏感性差，有假阳性且不能区分动物血清抗体阳性是病毒感染所致还是注射的疫苗所产生的抗体。赵增连等发现在琼脂板中加入3%的PEG6000，可提高AGP的敏感性，且快速省时。邓国华等利用杆状病毒表达禽流感病毒的重组白作为禽流感琼扩抗原，其特异性和敏感性有较大提高，生物安全性更可靠和生产成本更低廉。但该实验需要大量的抗原和抗体才出沉淀线，且需要至少24h才出结果，没有HI实验敏感、快速。

3血凝（IA）和血凝抑制（HI）试验

AIV能够与鸡红细胞发生凝集现象，即血凝实验。这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。HA主要用于AIV的鉴定，HI主要是用已知单因子血清进行AIV的亚型鉴定，也可用来测定血清中的HI抗体滴度。该方法最早在1942年Hirst采用，后经改进并建立了标准操作程序。由于许多禽类血清中有非特异性血凝因子，导致假阳性出现，故通常在斌验中首先用受体破坏酶或高碘酸钠法去除非特异性抑制因子。有报道用马血球替代标准HA中的鸡或猪血球检测禽流感H7，可提高敏感性达85%，特异性达100%。HA、HI特异性好，是亚型鉴定的常用方法，但其操作过程繁琐费时，并且用已知HA亚型的抗血清不能检出新的HA亚型的AIV。

4病毒中和试验（VNT）

VNT试验是最特异的血清学方法之一，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应，特别是与吸附到宿主细胞上的痫毒表面抗原相对应，才能在实验中取得满意的显示效果。因此，某一个血清型的中和试验抗体只与同组内的其他病原表现出有限的交叉反应。该实验还具有高度的敏感性，Thoms等建立的用于AIV H5N1检测的微量中和斌验的敏感性要高于HI试验，如同时结合运用H5型特异的westernblotting）试验，其敏感性可达80%，特异性达96%。VNT操作繁琐，费时间，耗材料，故在实际临床诊断中不常使用。但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要作用，许多新的检测方法都要以此作为标准进行比较。

5免疫荧光技术（IFA）

IFA是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。最早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞异性的抗原、白（NP）或基质蛋白（MP）抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体染色主要出现胞质荧光，核内也可出现部分荧光。1984年宾夕法尼亚州暴发禽流感时，Skeeles将IFA首次用于AIV的检测，其敏感性相当于病毒分离。现有一种微球免疫法（microsphere immunoassay，MIA）将重组NP结合于Luminex（聚苯乙烯微球）上检测禽流感，敏感性高达99.13%。秦爱建等研制的抗禽流感H5和H9亚型病毒的单克隆抗体，通过免疫荧光技术检测AIV，24h内检测出病毒的最小感染量为10个TCID50孔。IFA具有特异性强、敏感性好、简便快速的优点，但非特异性染色问题尚未解决、结果判定的客观性不足、技术程序比较复杂。

6酶联免疫吸附试验（ELISA）

它是20世纪70年代在荧光抗体和组织化学基础上发展起来的一种新的免疫测定技术，是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的条件下，使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或间接通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合，从而特异的定性、定量检测病毒的存在。由于标记酶酶促反应的放大作用，其灵敏度比常规血清学检测要灵敏得多，尤其适合大批量的血清学调查。酶联免疫吸附试验具有较高的敏感性，既可以检测抗体，又可以检测抗原，可以标准化，且结果易于分析，在流感的控制、扑灭、检疫中很有用途。目前由于AIV全病毒作为包被抗原建立的ELISA方法存在生物安全性问题，应用AIV型特异性蛋白及其单抗建立ELISA方法成为了研究的热点。

7反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

RT-PCR技术是指提取AIV总RNA，再加反转录酶合成cDNA，进行PCR扩增后，直接检查AIV基因。如果检测出了相应的扩增带则判为阳性反应；反之，无扩增带则为阴性反应。用于AIV检测的早期报道是在1986年Perdue等在接种鸡胚的尿囊液中检测AIV。近几年随着分子生物学的深入发展，用于AIV检测的RT-PCR方法不断得到改进和报道。2007年韩雪清等，根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2亚型NA基因的保守序列，设计出四对RT-PCR引物，建立一步法多重RT-PCR，能够特异、敏感地对禽流感Hl、H3、H5、N2四亚型进行快速检测，且与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV和IBDV的核酸均无交叉反应。同年张鹤晓等。进一步研制开发H5/H7和H5/N1多重荧光PCR技术，实现了在一次反应中对样本里的病毒进行快速定型，此法检测H5和H7的敏感性分别为10-6和10-5，而且与禽类其他常见病毒和禽流感病毒其他亚型未发现交叉反应。因此该检测方法将在大量检测H5和H7亚型禽流感病毒的混合感染方面，大大提高检测效率，节约检测成本。

8展望

近年来禽流感病毒的检测手段已经得到非常大的改进和发展，多种技术较为成熟，已经被开发成为商品性的试剂盒。当前我们所面临的最大挑战是流感病毒的变异，导致前面所述的方法不能检测新变异的病毒株，而病毒分离及现有的分子诊断方法也可能漏检。这就需耍广大科技工作者，通过AIV分子生物学、分子遗传学的研究不断优化禽流感诊断技术，使之更加完善，相信我们必然能够战胜该病，还人类和禽类健康平静的生存环境。