商陆正丁醇部位醋制前后肠道毒性变化研究

[摘要]为探索商陆毒性部位炮制前后对肠道毒性变化的影响，提取分离获得了商陆正丁醇毒性部位，在整体动物模型水平，灌胃给药后观察小鼠肠道肿胀程度，测定小鼠肠道不同部位的含水量及粪便的含水量，考察商陆正丁醇部位炮制前后对腹泻及肠道肿胀的影响；在细胞水平，采用MTT法，测定肠细胞HT-29，IEC-6的IC50，比较醋制前后商陆正丁醇部位的毒性变化。结果显示商陆正丁醇部位能够导致肠道肿胀，表现为引起十二指肠、空肠的水肿，且可导致粪便含水量增加引起腹泻，可抑制肠细胞HT-29，IEC-6增殖，表明其具有肠细胞毒性，对HT-29细胞的IC5014.59 mg・L-1，IEC-6 IC5043.77 mg・L-1；经醋制，小鼠肠道肿胀程度显著减弱，肠道和粪便的含水量明显降低，对HT-29和IEC-6的抑制作用减轻，对HT-29细胞的IC5058.51mg・L-1，IEc-6 IC5084.37mg・L-1。由此可知，醋制法具有降低商陆正丁醇部位的毒性作用。

[关键词]商陆；正丁醇部位；肠道水肿；腹泻；肠细胞增殖抑制；醋制减毒

中药商陆为商陆科植物商陆Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陆P.americama L的干燥根。商陆味苦、寒，有毒，归肺、脾、肾、大肠经。有逐水消肿，通利二便的功能。主治水肿胀满、二便不通。用于水肿尿少，腹水胀满，外治外伤出血、痈肿疮毒等。商陆药性峻猛，有大毒，可对胃肠道黏膜产生强烈的刺激，表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，严重者可导致呕血、便血，故临床上需炮制后应用。商陆生品粉末可引起家兔眼结膜强烈水肿，提取液能够刺激巨噬细胞释放炎症因子，醋制后毒性明显下降。课题组前期研究发现商陆正丁醇萃取部位具有强烈的刺激性，是商陆的主要毒性部位。本实验建立整体及细胞水平的毒性评价模型，比较商陆正丁醇部位模拟醋制前后对肠道毒性的变化，为商陆醋制解毒机制的研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器与试剂

Spring-S15i超纯水发生器；KQ-500DE型医用数控超声清洗器；Rotavapor R-210旋转蒸发仪（BU-CHI）；HH-2K4二列四孔智能水浴锅（南京科尔仪器设备有限公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；Spectra Max 190酶标仪（美国AD公司）。石油醚（南京化学试剂有限公司）；二氯甲烷（南京化学试剂有限公司）；正丁醇（南京化学试剂有限公司）；二甲亚枫（南京化学试剂有限公司）；羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）；胎牛血清（美国WISENT公司）；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；青链霉素混合液（无锡海硕生物有限公司）；生理盐水（南京小营药业集团）；镇江香醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；PBS缓冲液（Thermo公司）。

1.2 药材

生商陆饮片购自精华制药亳州康普有限公司（云南产，批号131201）。药材经江苏省食品药品检验所胡皓彬主任药师鉴定为商陆科植物美洲商陆商陆科植物美洲商陆P.americana的干燥根。

1.3 动物与细胞

ICR小鼠，雄性，体重18～22 g，由南京市青龙山繁殖场提供，动物许可证号SCXK（苏）2012-0004。HT-29，IEC-6均购自ATCC。

2 方法

2.1 样品的制备

取原药材1 kg，加8倍量70%乙醇回流提取2h，提取2次，合并乙醇提取液，提取液减压浓缩后先用石油醚、二氯甲烷萃取，再用水饱和正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，得到正丁醇部位浸膏200g；取正丁醇浸膏50g，根据饮片炮制加醋量和浸膏的得率，加75 g食醋，100℃煮30 min，减压浓缩，蒸干，得到醋制后浸膏。取生商陆浸膏、醋商陆浸膏适量，加CMC-Na配置成质量浓度为108 g・L-1的混悬液用作高剂量组，加CMC-Na配置成质量浓度为10.8 g・L-1用作低剂量组。取醋适量配置成质量浓度为162 g・L-1作为醋制空白组。

2.2 商陆正丁醇部位醋制前后对小鼠肠道的影响

ICR小鼠按体重随机分为6组，每组8只，分别为空白组、醋制空白组、生商陆和醋商陆低剂量组（270 mg・kg-1，相当于临床日用剂量）、生商陆和醋商陆高剂量组（2 700 mg・kg-1，相当于临床日用剂量的10倍）。实验前将各组动物禁食不禁水24h。各给药组按0.025 mg・g-1灌胃给药，空白组给予同等体积的CMC-Na。3 h内收集各组小鼠粪便，称重后放入70℃烘箱1 h，记录干燥前后粪便的质量；3 h后小鼠脱颈处死，打开腹腔分离肠系膜，观察肠道整体膨胀程度，并在十二指肠、空肠、回肠、结肠处各取2～3 cm，称重后放入70℃烘箱1 h，记录干燥前后肠道的质量，计算各肠道含水量。

2.3 商陆正丁醇部位醋制前后对HT-29，IEC-6细胞毒性的影响

HT-29，IEC-6细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（100U・mL-1青霉素和100 mg・L-1链霉素双抗），37℃，5%CO2培养箱中培养并传代。取对数生长期的HT-29，IEC-6细胞，按每孔5×103个细胞接种于96孔板，贴壁24 h后弃去培养液。分别加入100μL下述培养液：含DMSO的RP-MI 1640培养液，含一定浓度醋的RPMI 1640培养液，含一定浓度的正丁醇部位和醋制正丁醇部位的RPMI 1640培养液。每组均设6个复孔，于37℃，5%CO2孵箱中培养24 h后加20μL的MTT，继续培养4 h后弃去上清，加入DMSO后震荡10 min，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度，检测波长490 nm，并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（1-A实验组/A对照品）×100%。

3 结果

3.1 商陆正丁醇部位醋制前后对小鼠肠道的影响

3.1.1 对小鼠肠道刺激性的影响

商陆正丁醇部位醋制前后对小鼠肠道刺激性的影响见图1。结果显示，未经醋制的商陆正丁醇部位能显著引起小鼠肠道肿胀，且高剂量组比低剂量组更为明显，表明商陆正丁醇部位对小鼠肠道具有明显毒性作用。正丁醇部位醋制后小鼠肠道未见明显肿胀，与空白组相比无显著差异，表明经醋制后商陆的正丁醇部位刺激性显著降低。

3.1.2 对小鼠肠道不同部位含水量的影响 为进一步研究正丁醇部位引起的肠道肿胀的原因，本实验对小鼠肠道不同部位进行了含水量测定，见表1。结果显示，商陆正丁醇部位高低剂量组均能够显著增加十二指肠、空肠的含水量，而对回肠及结肠无明显影响，表明商陆正丁醇部位所致的肠道肿胀是由于其可导致显著的小鼠十二指肠、空肠水肿。商陆正丁醇部位经过醋制后，其引起的小鼠十二指肠、空肠的含水量显著下降，表明醋制能够降低正丁醇部位对小鼠肠道水肿。

3.2 对小鼠粪便含水量的影响

给药1h后，正丁醇高剂量组小鼠均出现不同程度的精神萎靡、行动迟缓、运动减少，少数小鼠出现昏睡、竖毛等症状，而空白组和醋制正丁醇组均未出现上述现象。商陆正丁醇高、低剂量组小鼠肠腔内粪便呈现稀便状，与空白组相比均能显著增加小鼠粪便的含水量。醋制后，小鼠状态良好，同时小鼠肠腔内粪便形状正常，粪便含水量显著降低，表明醋制可以缓解其腹泻的毒副作用，见表2，图2。

3.3 对HT-29，IEC-6增殖抑制作用

商陆正丁醇部位对体外培养的HT-29，IEC-6具有较强的抑制作用，在测定范围内呈现出良好的剂量依赖性，表明商陆正丁醇部位具有肠细胞毒性，醋制后对HT-29，IEC-6抑制作用减弱，说明醋制能够减轻商陆正丁醇部位对肠细胞的毒性，见表3。

4 讨论

商陆由于其毒性临床使用前必须经过炮制，以醋为辅料的炮制方法沿用至今，商陆正丁醇萃取部位和饮片经过醋制后，其刺激性毒性都显著降低，为了本实验后续研究商陆正丁醇部位中皂苷类成分醋制前后变化规律，防止商陆饮片醋制后萃取过程中皂苷类成分的损失，本实验通过对商陆正丁醇部位醋制来模拟商陆饮片的炮制方法，研究商陆正丁醇部位醋制前后对肠道毒性的影响。

商陆属于中医传统的峻下逐水药，由于其药性峻猛，毒副作用大，商陆临床毒性主要表现为胃肠道反应，如恶心呕吐、腹痛腹泻，严重者可导致便血。肠道是水液电解质运转的主要场所，每天进入肠道的水约为9L，当水液运转发生障碍时，肠腔水液无法进入机体血管，根据肠上皮细胞基底侧与顶端水通道蛋白的调控，滞留的水液可能积聚在肠腔内，导致肠道内粪便的含水量升高，从而引发腹泻；也可能积聚在肠细胞内部，导致肠道含水量升高，从而引发肠道水肿。与此同时肠黏膜固有层中的免疫细胞能够抵御外来抗原的入侵，保护机体的健康。当外界刺激物进入肠腔，肠道免疫系统过度激活，释放大量炎症介质使得肠道肿胀。课题组研究发现商陆的正丁醇部位以及以正丁醇部位中商陆皂苷c和F为代表的皂苷类成分具有强烈的刺激性毒性，能够刺激巨噬细胞释放大量炎症因子。本实验通过正丁醇萃取得到商陆皂苷的富集部位，模拟饮片的炮制方法对正丁醇部位进行醋制，进一步研究醋制前后商陆正丁醇部位对小鼠肠道毒性的影响。结果显示商陆正丁醇部位可导致小鼠十二指肠、空肠水肿，并可导致腹泻。表明本实验采用的整体动物毒性模型能较好的反应商陆的临床毒性表现。

肠黏膜屏障是机体屏障系统的重要组成部分，能够抵御外来抗原物质对机体的侵袭，肠黏膜功能障碍可诱发肠道病变，导致腹泻、便血等。肠上皮细胞是肠黏膜机械屏障主要组成部分，肠上皮细胞损伤导致肠粘膜屏障破坏，肠道功能紊乱，从而引发腹痛腹泻。本实验研究发现，商陆正丁醇部位对小肠上皮细胞IEC-6、结肠上皮细胞HT-29具有细胞毒性作用，表明商陆正丁醇部位能够破坏小肠和结肠肠上皮细胞的机械屏障，引起肠道损伤。

本实验在整体及细胞水平建立了商陆毒性评价模型。本文结果显示，商陆正丁醇部位经醋制后，其导致的肠道水肿、腹泻明显减弱，其对肠上皮细胞IEC-6，HT-29的增殖抑制作用亦显著降低，表明醋制能够缓解商陆正丁醇引起的肠道毒性，表明商陆传统的醋制方法科学有效，为商陆临床炮制用药提供合理的依据。