Mn超富集植物商陆的多倍体诱导与修复性能

摘要：以Mn超富集植物商陆（Phytolacca acinosa Roxb）幼苗为试验材料，研究了不同秋水仙素浓度和处理时间对商陆多倍体诱导的影响，并对诱导的多倍体与二倍体进行了形态、染色体、生物量和修复性能的鉴定比较。结果表明，0.5 g/L的秋水仙素处理24 h诱导效果最好，变异率达到46.7%；多倍体植株的叶宽、叶厚、花直径和气孔面积等形态参数均显著大于二倍体；根尖细胞的压片镜检表明，变异材料的染色体数（2n=4x=72）为二倍体对照（2n=2x=36）的两倍；不同Mn浓度处理时多倍体商陆根、茎和叶的生物量（干重）均比二倍体增加，且多倍体平均单株Mn富集量达到14.85 mg，远高于二倍体的7.73 mg。

关键词：Mn超富集植物；商陆（Phytolacca acinosa Roxb）；多倍体；诱导；修复性能

中图分类号：Q943；X173 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4623-04

植物修复以其成本低廉、原位治理、美化环境且无二次污染等优点[1，2]已成为环境科学领域的研究热点，应用前景广阔。但作为植物修复的核心内容，超富集植物本身也有着在天然条件下生物量小和生长缓慢等缺陷[3，4]，限制了植物修复效率，种植这样的植物要实现修复目标往往需要较长的周期，这是制约植物修复技术工程化推广中最主要的瓶颈。因此，培育生物量大、重金属富集和耐受能力强的优质超富集植物是突破上述瓶颈的关键。多倍体育种技术是经典的育种技术之一，人们通过倍性育种技术已经获得了品质优良和抗逆性更强的农作物、药材和花卉等[5，6]，这为突破上述瓶颈提供了新的思路。

商陆（Phytolacca acinosa Roxb）为商陆科商陆属多年生草本植物，分布在我国安徽、湖北和河南等省，多生于疏林下、林缘、路旁、山沟等气候湿润的地方，目前已被鉴定为Mn超富集植物[7]。研究以商陆为材料，利用秋水仙素对商陆进行多倍体诱导，通过同源染色体数目的增加，增强植物原有基因的表达能力，以期培育出高产优质的商陆新品种，并通过与二倍体对照的生物量和重金属富集量比较，评价其应用于植物修复领域的潜力及效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

商陆种子于2011年取自广西自治区桂林市雁山植物园，2012年4月选取培养室中培育出的商陆试管苗作多倍体诱导材料。

1.2 商陆多倍体的诱导

采用正交试验，用0.2、0.5、0.8、1.0和2.0 g/L的秋水仙素和3.0 g/L的琼脂溶液处理商陆幼苗的顶芽生长点，以无菌水滴液处理作为对照。试验对幼苗的诱变时间设为24、48和72 h，处理后用无菌水洗净残留药液，栽入河沙中。每个处理设30次重复。苗期管理于温室中进行，定期浇灌Hoagland营养液。60 d后统计成活率和变异率。

1.3 商陆多倍体的筛选与鉴定

形态学筛选：观察商陆植株的茎、叶片等外观形态特征，并与对照组植株进行比较。以茎增粗、叶片增大、变厚、叶色浓绿等特征进行初步筛选，测量株高、叶厚等参数。分别计算多倍体和二倍体叶下表皮20个气孔器的长、宽和气孔器面积。

1.4 商陆二倍体与多倍体的锰污染土壤修复试验

将筛选的二倍体和多倍体商陆移栽入装有3.5 kg混有重金属锰的河沙的花盆内，锰的浓度设为0、125、250、500、750和1 000 mg/kg，每个处理设3次重复，放入温室浇水培养。30 d后收获植物，洗净分离后，用减重法（电热烘箱GZX-9240MBE）测定根、茎、叶的生物量干重，用原子吸收火焰法（PE-AA700）测定植株内重金属含量。

1.5 数据分析

试验所得数据用SPAW Statistics 18软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 商陆多倍体最佳诱导浓度与处理时间的确定

不同浓度和不同处理时间的秋水仙素对商陆顶芽诱导的结果见表1。由表1可知，不同组合的成活率和变异率存在明显差异。随着秋水仙素浓度的升高和处理时间的延长，商陆成活率呈明显下降趋势，表明秋水仙素对商陆生长有一定的毒害作用；0.5、0.8 g/L秋水仙素处理24 h的变异率较高，但0.5 g/L秋水仙素处理的成活率达到86.7%，明显高于0.8 g/L秋水仙素处理的63.3%。由此得出，商陆在0.5 g/L的秋水仙素处理下24 h诱导效果最好。

2.2 商陆多倍体与二倍体比较

2.2.1 商陆多倍体与二倍体的形态学比较 二倍体与多倍体商陆外观形态差异明显：二倍体商陆体型高大，叶色呈浅绿或者黄绿，叶面平整，叶缘光滑，茎细长呈浅红色；多倍体商陆粗壮矮小，叶色深绿，叶片大而肥厚并且翻卷、叶边缘呈不规则锯齿状，茎粗短呈紫红色。由表2可知，多倍体商陆较二倍体商陆叶宽和叶厚分别增加了35.60%和44.83%，花直径增加了18.68%，株高和叶长分别减小了9.28%和12.54%。总体而言，多倍体表现出生物量增大的趋势。

通过显微观察测量（表2，图1），并用SPAW Statistics 18软件对20个气孔器长、宽及一定叶面积内（16 824.50 μm2）气孔器总面积进行分析，结果表明，多倍体商陆气孔器的长、宽及一定叶面积内气孔器总面积都明显大于二倍体商陆，其中，多倍体商陆气孔器长和宽较二倍体商陆分别增加了36.05%和42.60%，一定叶面积内气孔器总面积增加了24.81%。

2.2.2 商陆多倍体与二倍体的细胞学比较 对多倍体和二倍体商陆进行根尖细胞染色体鉴定，结果（图2）表明，二倍体商陆的染色体数为2n=2x=36，经多次观察多个根尖细胞，发现多倍体染色体数为36～72条不等，最后观察到同源四倍体染色体数为2n=4x=72，这说明用秋水仙素处理顶芽诱导获得商陆同源多倍体的方法是有效的，用以上形态指标鉴定多倍体也是可行的。

2.3 不同浓度Mn处理商陆多倍体与二倍体生物量与Mn富集量比较

从生物量方面（表3）看，30 d收获时，不同Mn浓度处理下多倍体商陆的各部分生物量（干重）均明显大于二倍体。不同Mn浓度处理对多倍体与二倍体各部分生物量的影响相似： 高Mn浓度（750 mg/kg和1 000 mg/kg）处理的多倍体和二倍体地上部分生物量与对照（0 mg/kg）相比都明显减少，差异显著，而Mn浓度为125、250、500 mg/kg处理时则对多倍体与二倍体地上部分生物量无显著影响。不同Mn浓度处理下多倍体和二倍体根系生物量较对照无明显变化，差异均不显著。

不同Mn浓度处理的多倍体与二倍体商陆的Mn富集量也不同。图3结果表明，多倍体商陆的平均单株Mn富集量达到14.85 mg，而二倍体商陆的平均单株Mn富集量仅为7.73 mg。研究表明，不论二倍体商陆还是多倍体商陆，单株植物的富集量均在Mn浓度为500 mg/kg时达到最高，此时二倍体单株Mn富集量为12.3 mg，而多倍体单株Mn富集量可以达到21.2 mg，单株植物的Mn富集量增加。

3 讨论

目前国内外学者对超富集植物倍性育种方面的研究较少，主要集中在种质资源与鉴定、富集机制、杂交育种与强化措施等方面[8-10]。在商陆多倍体诱导过程中，改良琼脂涂抹法具有很强的可操作性，即试验材料充足，试验条件容易控制，试验结果可靠[11，12]。研究发现，用0.5 g/L的秋水仙素处理锰超富集植物商陆顶芽生长点24 h效果最好，变异率达到46.7%，诱导得到的部分变异多倍体经染色体数目鉴定为四倍体，说明利用秋水仙素诱导商陆多倍体的方法是可行的，这也为超富集植物种质资源的发掘提供了新的思路。

多倍体植株较矮壮，因此它比二倍体具有更好的抗倒伏性，其叶片宽、厚和花直径等形态参数均明显大于二倍体，符合多倍体组织巨大性的特点，这和Zhang等[13]研究甜瓜的结果类似。多倍体植株还表现出叶色深绿、叶边缘粗糙等外观形态，这与He等[14]、莫官站等[15]的研究结果类似。此外，多倍体气孔器的长、宽及一定叶面积内气孔器总面积都明显大于二倍体，这与Banyai等[16]、Harbard等[17]的研究结果类似。综上所述，商陆多倍体的形态变异规律基本符合一般多倍体植物变异规律，可以利用形态指标进行多倍体的初步筛选。

生物量是制约超富集植物重金属修复效率的重要因素，如果在植物富集能力不降低的情况下，生物量的增加无疑会导致植物修复效率的增加。研究结果显示，不同Mn浓度处理时多倍体商陆的根、茎和叶的生物量均大于二倍体，表明多倍体商陆较二倍体商陆可能具有更高的植物修复效率。此外，不同Mn浓度处理对多倍体与二倍体各部分生物量的影响相似，初步说明多倍体商陆较二倍体商陆对Mn的耐性可能并未降低，但已有研究表明，植物对重金属的抗性与某些蛋白质和酶的解毒作用密切相关[18]，因此结果还有待验证。

多倍体商陆与二倍体商陆的土培试验结果表明，多倍体商陆的单株Mn富集量明显高于二倍体，这意味着多倍体商陆具有更强的重金属富集能力，进而印证了上述生物量增加导致植物修复效率增加的推测，而植物修复效率的增加能有效缩短单位面积重金属污染土壤的修复周期，因此超富集植物的多倍体育种在植物修复领域有着广阔的应用前景。此次试验诱导出了大量商陆多倍体，经检测，染色体倍数并不稳定，既有整倍体，也有混倍体，需继续培养及运用组织培养技术分离和筛选出大量稳定的商陆多倍体植株。

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