采用正交设计优化白芨组织培养快繁体系

摘要：微繁技术是白芨种苗大规模生产的一种主要途径。本文以1/2MS、MS和MS+马铃薯汁三种为基本培养基，结合NAA和6-BA两种植物激素，采用正交设计实验法研究不同浓度配比对白芨原球茎诱导的影响。结果表明：对白芨原球茎诱导最适培养基为MS+马铃薯汁NAA（0.1mg/L）+6-BA（1mg/L），以期提高白芨组织培养的效率，为其快繁及大规模工厂化生产提供依据。

关键词：白芨；组培快繁；植物激素；正交设计；原球茎诱导

中图分类号：S567.23 文献识别码：A 文章编号：1001-828X（2015）013-000-02

一、引言

白芨（Bletiua striata （Thunb.） Reichb.f.）属兰科白芨属植物，有较高的观赏价值，深受人们喜爱[1]。白芨块茎可入药，具有消肿生肌的功能，在临床上使用较多[2]。但白芨的种子微小，无胚乳发芽所需养分，在自然状态下极少萌发成苗。传统的人工栽培通常采用分株繁殖，其繁殖效率较低，周期长[3]。目前关于白芨组织培养的报道极少[4]。其繁殖速度快，周期短，管理方便等优点的植物组织培养技术是白芨快速繁殖方法的重要选择。

采用正交设计法可用最少的处理组合数研究较多的试验因素，在农业研究中广泛应用[5]。使用正交设计可以用较少的实验次数获得较多的信息，以达到精简实验次数结果[6]。正交设计在组织培养研究中应用的报道不多[7-8]，它不仅可以通过分析实验结果选择最佳的培养条件，还可以揭示各因素对培养效果作用的相对大小。

本文试验选用白芨无菌原球茎为外植体，在1/2MS、MS、MS+马铃薯汁三种基本培养基中附加了不同浓度的NAA和BA，采用正交试验设计进行了原球茎的诱导试验，旨在确定白芨丛生芽诱导的最佳培养基，以期提高白芨组织培养的效率。为其快繁及大规模工厂化生产提供依据。

二、材料和方法

1.供试材料

材料采自云南农业大学园艺系实验室内白芨苗，取其原球茎作为样品。

2.方法

（1）外植体的选择

本次试验选用无菌白芨原球茎作为外植体[9]，将原球茎用刀片切分为四小块，分别接种到九种不同的培养基上，每个处理3次重复，每次重复接种5个外植体，共接种27瓶。培养温度（25±2）℃，光照强度2500Lx，光照时间12h/d，培养25d进行出芽率的统计，并转接到继代培养基上进行继代培养。

（2）正交优化体系

丛生芽诱导以1/2MS、MS和MS+马铃薯汁三种培养基为基本培养基，按L9（33）正交表设计试验，设置A，B因子分别为NAA，6-BA浓度，各因子的水平均设置为0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L和1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L。

（3）数据统计与分析方法

出芽率（%）=发芽数/接入未被污染的外植体数x100%，记录三次重复的平均数作为最终结果。采用DPS数据处理观测数据，确定NAA和6-BA不同浓度对白芨丛生芽诱导数量和生长的影响，以筛选出对白芨丛生芽诱导的最佳培养基。

（4）白芨生根与移栽

将诱导出的丛生芽切成单苗转接到生根培养基上。培养温度（25±2）℃，光照度2000～2500lx，光照16h/d。生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L。白芨组培苗壮苗生根后，当苗约4cm时，可炼苗移栽，取出小苗，用自来水把营养基冲洗干净，再栽入已经准备好的基质中。

三、结果与分析

1.出芽率的统计

从表1可以看出培养40d后：NAA浓度为0.1mg/L，BA浓度在1.0～2.0mg/L之间，丛生芽诱导率较高。且在诱导分化过程中，生出大量根。结果表明，细胞分裂素6-BA和生长素NAA均对白芨原球茎诱导有较大的影响。（见表1）

2.不同培养基对白芨原球茎诱导的影响

在设定的九种处理中，将基本培养基设为A，NAA浓度设为B，6-BA浓度设为C，Duncan法检测结果表明：各水平之间差异不明显，结合诱导率的直观分析和正交试验优选原则，从均值上看（由表2），可得出B因素（NAA）3水平中，B1（0.1mg/L）时和C因素（6-BA）3水平中，C1（1.0mg/L）时效果最好。因此，3种生长物质的最佳配比为A3B1C1，即培养基组合为MS+马铃薯汁+NAA（0.1mg/L）+6-BA（1.0mg/L）。

3.白芨组培苗的扩繁、生根与移栽

在无菌操作条件下，将诱导出的丛生芽接种到生根培养1/2MS+NAA0.5mg/L，30d后待植株健壮，移栽到经消毒的基质中，适度遮荫，保持一定的湿度。光照由弱加强，直到接近自然光照待组培移栽苗新叶展开和新根长出后，即可按常规管理。

四、讨论

采用正交设计的方法，通过统计学分析，明确了白芨愈伤组织诱导的主要因素，同时优化筛选了白芨愈伤组织诱导的最佳培养基，充分发挥了正交设计法的优势。白芨的继代培养基中添加马铃薯汁，不仅起到凝固作用，还抑制褐化、为白芨增殖提供营养物质达到降低生产成本目的。可促进假鳞茎明显增粗和形成。

参考文献：

[1]王熊.地生兰（Cymbidium）个体发生途径研究[J].植物生理学报，2003，16（3）：264-267.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：1部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：95.

[3]黄泰康，孔令义.中药创新研究与高新技术应用[M].北京：中国医药科技出版社，2002：185，177-178.

[4]Amaki W ，Haguchi H .Effects of dividing on the growth and organo-genesis of portocorm 一like bodies in Doritaenopsis[J].Sci Hort，2003，39（1）：63-72.

[5]张菊红，谢妤，汪承刚，等.正交设计在欧洲菘蓝组织培养中的应用[J].湖北大学学报（自然科学版），2006，28（2）：183-186.

[6]杜荣骞.生物统计学.北京：高等教育出版社，1989：419.

[7]张治国，等.正交设计在植物组织培养研究中的应用.植物生理学通讯，1985（5）：46-48.

[8]李艳，王青，李英慧，等.正交设计在黄金鱼花组织培养中的应用.园艺学报，200l，28（6）：570-571.

[9]石云平，赵志国，唐凤鸾，等.白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究[J].中草药，2013，44（3）：349-353.

作者简介：成晓静（1990C），女，山西省霍州人，硕士研究生，现主要从事蔬菜生物技术与遗传育种。

责任作者：杨正安（1974C），男，云南昆明人，副教授，现主要从事蔬菜生物技术与遗传育种。