黄芪失笑散对鸡胚绒毛尿囊膜促血管生成实验研究

摘要：目的：通过鸡胚绒毛尿囊膜(chrioall antoie membrane，CAM)模型以探讨黄芪失笑散的促血管生成的作用及机理。为进一步开发及临床应用提供实验依据。方法：取SD大鼠16只随机分成模型组、消心痛组、黄芪失笑散大剂量组。消心痛和黄芪失笑散大剂量组分别进行灌胃10天，末次灌胃后1.5h取血制成含药物的血清，黄芪失笑散小剂量组药物血清以黄芪失笑散大剂量和模型组等剂量配置而成。然后分别以贝复济组(碱性成纤维细胞生长因子bFGF)和模型组分别为阳性和阴性对照组作用CAM，通过进行一级及二级血管计数来评价黄芪失笑散的促血管生成活性并初步探讨其作用机理。结果：黄芪失笑散大剂量在CAM一级及二级血管数目上均与贝复济组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论：黄芪失笑散具有显著促血管生成作用。

关键词：黄芪失笑散；CAM；促血管生成；实验研究

中图分类号：11285.5

文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2007)12-2462-03

大量研究表明，补气活血方药具有促血管生成作用。黄芪失笑散是由大剂量的黄芪合失笑散组成的益气活血化瘀方，经笔者长期临床观察，应用该方治疗冠心病心肌缺血患者，可有效缓解胸闷隐痛、心悸气短、动则益甚等症状。笔者分析此方可能对缺血心肌有促血管生成作用，为此笔者采用CAM模型通过计数一级及二级血管来评价黄芪失笑散促血管生成活性以探讨其作用机理。

1.实验材料

1.1实验动物及分组给药　6周龄清洁级健康雄性SD大鼠16只，体重(200±20)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分成模型组(给予等体积蒸馏水3mL)，消心痛组[12mg/(kg・d)]，黄芪失笑散大剂量组[28g/(kg・d)]，消心痛加黄芪失笑散大剂量组[12rag/(kg-d)+28g/(kg・d)]，每组各4只。最终灌胃体积为3mL。

1.2药品与仪器　黄芪失笑散(由黄芪30g，蒲黄20g，五灵脂20g组成。浓缩成2g/mL的生药煎剂。)：由杭州市中医院中药制剂室提供。消心痛：购自江苏方强制药厂。贝复济(外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子)：珠海亿胜生物制药有限公司。1：1000的新洁尔灭：杭州市中医院自制。甲醇：上海振兴化工一厂。丙酮：衢州巨化试剂有限公司。GNF-9050型隔水式恒温式培养箱：上海精宏实验设备有限公司。解剖显微镜：美国光学仪器公司。图像摄录分析系统：法国ampharmacia公司。

2.实验方法

2.1药物血清的制备　以上各组按上述相应的药物和剂量灌胃10天，每天的剂量分早晚两次灌服，末次灌胃(禁食不禁水12h)1.5h后，取血分离血清，56℃灭活30min，0.20μm微孔滤膜过滤，置于-20℃保存备用。

2.2鸡胚绒毛尿囊膜的制备　①种蛋的分组：选用104只种蛋，放置在恒温式培养箱中进行孵化，在孵化过程中随时弃去未受精蛋，孵化第9天随机分为模型组(a组)、消心痛组(b组)、黄芪失笑散小剂量组(c组，以黄芪失笑散大剂量组和模型组等剂量血清混合而成，相当于大剂量组半量)、黄芪失笑散大剂量组(d组)、黄芪失笑散大剂量组加消心痛组(e组)、贝复济组(f组)。

②鸡胚绒毛尿囊膜模型的制备：参照付生法、姜志钢的方法并略加以改进。种蛋选择：选择种蛋表面清洁，蛋壳均质约(50±2)g，蛋皮无破损、裂皮、有明显气室、气孔均匀的种蛋，产后1周后做实验孵育。

种蛋的消毒：温水清洗2次后，在1：1000的新洁尔灭液中浸泡3min。

种蛋的孵育：使用培养箱(37.8±0.5)℃孵育，培养箱保持一定的湿度(60％)和通风换气条件。种蛋的钝端向上鸡蛋长轴与蛋托呈80。角，垂直方向前俯后仰45。，每天至少2-4次转蛋，以防止鸡胚粘壳。

鸡胚的检查：用照蛋灯在蛋钝端照明时，可以容易看到气室和胚胎发育的标志特征。

假气室的制备：孵化第9天用碘伏和75％酒精消毒蛋壳，然后在据胎头前1cm两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位用铅笔画出1cm x 1.5cm长方形区，再用碘伏和75％酒精消毒蛋壳，在种蛋的钝端用注射器针头开一小孔，用牙科细砂轮沿长方形区的边线磨切透卵壳，用眼科镊夹住长方形卵壳两端平行向上提起，暴露出下方卵壳膜，倾出卵壳粉尘。用注射器针头在卵壳膜上轻轻划破直径为1mm的小孔，在小孔处滴加少许无菌蒸馏水，用眼科镊轻轻拨起小孔边缘的卵壳膜，让液体浸入卵壳膜与鸡胚绒毛膜之间，待鸡胚绒毛膜下沉后剪除长方眶内卵壳膜。

加入药物血清：将无菌的直径为6mm的微孔滤膜载体放在血管最少处，在微孔滤膜上加以上各组的含药物血清10μL，而f组直接加贝复济10μL，然后用透明胶纸封闭卵壳开口，继续置于培养箱中孵化。加被测物3天后，在种蛋的钝端的小孔处加入甲醇：丙酮=1：l固定液2.5mL，取下鸡胚并与蛋壳分离，剪成以微孔滤膜为中心半径约为9mm圆，放人盛有少量水并铺有滤纸的平面皿里展开，阴干，连同滤纸保存。在解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘1mm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm处为二级血管分别观察分析。血管计数可结合自动图像分析系统摄像等技术完成图像进行SPSS11.5统计学分析，得出结论。

2.3统计方法　所有数据以均数±标淮差(x±s)表示，应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析比较各组间差异。

3.结果

取种蛋104只，其中无受精蛋及弱精蛋64只被弃去。在第9天至第12天共死亡4只，分析原因在于磨切蛋壳时伤及卵黄静脉而致胚胎缺血致死。最后每组各存活6只。统计结果见表1。

4.讨论

鸡胚绒毛尿囊膜技术是国内外研究血管生长常用的实验技术，可用于研究诱导血管生长或者抑制血管生长，是药物对微血管作用理想体内模型。鸡胚血管生长的特点：孵育的第3～5天、7～10天血管生长最活跃，12天以后CAM血管逐渐萎缩。5～6天左右，绒毛膜与尿囊膜发生融合，选取8～12天为药物刺激最佳时间。由于鸡胚血管网到第8天发育成毛细血管丛快速增长持续到第11天，此时机体的免疫系统尚未完全建立，鸡胚处于对各种外来抗原免疫耐受阶段，对所加测试药物不会产生排斥反应，笔者是在孵育第9天加入被测试物而不产生排斥反应，能真实反应出药物疗效。本实验是使用含药物的血清避免了直接加入药液对鸡胚的损伤而且实验结果可在解剖显微镜下或肉眼下直接观察，并可将图像输入计算机，进一步观察新生血管情况。量化观察指标。

益气活血化瘀法是以祖国医学气血理论为指导的。《素问》提出“血实者宜决之，气虚宜掣引之”。清代王清任明确提出“元气虚，必不能达于血管，血管无气，必然停留而瘀”。气虚则运血无力，血行无畅，凝滞而瘀，心失所养，最后形成心脉痹阻。并且血瘀又可加重气虚。冠心病主要表现为本虚标实之证，气虚为本，血瘀为标。治以补气为主，辅以活血化瘀，使元气得复，血活瘀去，气血调畅。笔者基于多年的临床经验及中医传统理论，提出冠心病多为气虚血瘀所致，根据这一病机而制备益气活血化瘀方一黄芪失笑散。实验证明黄芪具有促血管生成的作用。研究表明失笑散具有很好抗血栓形成和溶栓作用。二者联用以大剂量黄芪补气，失笑散活血化瘀共达益气活血化瘀之功，临床治疗冠心病心绞痛，可有效缓解胸闷隐痛，心悸气短，动则益甚等症状。

本实验结果提示黄芪失笑散能有效促进血管生成，其有效改善缺血心肌的血供可能源于血管薪生的作用。但促血管生成作用源于黄芪抑或失笑散功效还是三药联合功效有待以后进一步拆方研究。