热回流技术提取长裙竹荪多糖的工艺研究

本研究为了优化热回流法提取竹笋多糖的提取工艺，以多糖提取率为指标，通过单因素及正交实验对提取工艺进行优化，主要考察了提取料液比、时间、提取pH等因素。研究结果显示热回流法提取长裙竹荪多糖的最优工艺为料液比（110：1）、时间（2小时）、提取pH（5.0），采用此条件下提取长裙竹荪多糖提取率为（18.65±0.259）%，同时该工艺具有良好精密度与重复性，适用于长裙竹荪多糖的提取。

多糖为生命代谢活动中不可或缺的重要部分，是几个或多个单糖之间通过糖苷键连接形成的高分子化合物，可广泛地参与人体的各项活动，如抗衰、增强免疫力、皮肤保湿、抗肿瘤、抗病毒等。目前化妆品中皮肤保湿剂主要包括化学保湿剂（如甘油、丙二醇）和多糖保湿剂（如透明质酸、植物多糖）。由于从动植物中提取的多糖类物质具有天然、安全无刺激、与皮肤亲和力较高等优势，因此多糖类物质在化妆品中的应用受到了人们的广泛关注，可满足人们对高品质化妆品的需要。目前已知的多糖研究主要有植物多糖、动物多糖、真菌多糖、细菌多糖、藻类多糖等，其中真菌多糖的研究是目前的一个热点。

竹荪为高蛋白、多氨基酸、多维生素、低脂肪、营养丰富的食药兼用的高等真菌竹荪菌盖，多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖含量最高，其次是半乳糖和甘露糖。竹荪菌盖多糖具有较好的还原能力和抑制羟基自由基能力。随着菌盖多糖质量分数的增加，其还原能力和抑制羟基自由基能力有定程度提高，其中菌盖多糖的还原能力与质量分数具有一定的线性相关性。据文献报道，竹荪提取液在化妆品中的应用很少，并且对其作用机理尚未研究；其研究主要是在医药（抗癌、抗菌、降血脂）与食品方面（防腐）等方面的报道。竹荪提取液应用到化妆品中，具有潜在的美白、抗衰老、防晒及抗痤疮等方面的功效。竹荪提取液与其他美白剂抗衰剂相比，在起到美白、抗衰作用的同时，还具有多糖固有的保湿作用。若能利用竹荪菌托、菌盖来深入研究多糖在食品天然防腐剂、保健品、化妆品中的应用，对我们的生活会影响深远。

长裙竹荪（Dictyophora indusiata）是一类大型真菌，又称竹菌、竹参，从分类学上隶属于担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、竹荪属。长裙竹荪味道鲜美、营养丰富，既是驰名的名贵药材又是宴席上的名贵山珍，因此素有“菌中皇后”“山中之王”美称。对于真菌多糖的提取主要有热水浸提法、酸碱浸提法、超声波法、微波法、酶法、超声酶法等，但目前对于长裙竹荪多糖的提取报道不是很多，主要有热水提取法及复合酶法等。作为种名贵的食用菌，随着人们对长裙竹荪需求量的增大，对长裙竹荪多糖的研究也逐渐深入，如何在现有提取方法基础之上加以完善优化以获得更大提取率的长裙竹荪多糖非常有研究意义。本研究以长裙竹荪为研究对象，采取常规的热回流技术对料液比、提取时问、不同pH等进行了单因素分析及正交试验，研究了长裙竹荪多糖的提取工艺，并通过对提取条件的优化筛选了最佳工艺，为进一步开发长裙竹荪的价值提供了依据，希望为竹荪活性成分在化妆品领域的应用提供科学依据。

1.材料与方法

1.1材料与仪器

长裙竹荪（购自福建宁德）；苯酚、葡萄糖、硫酸等均为分析纯（购白北京化工厂）。

Tecan Genios，型号M200酶标仪（瑞～Tecan公司），移液枪（大龙），天秤（赛多利斯），电子调温电热套（江苏金坛），电子恒温水浴锅（江苏太仓），酸度计（梅特勒托利多）。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线绘制

精密称取烘干至恒重的葡萄糖0.1g，置于烧杯中加水溶解定容至100ml，吸取1ml再定容至5ml，得0.2mg/ml标准葡萄糖溶液。准确分别吸取0.2mg/m【标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分别置于试管中，各加入蒸馏水使总体积为2.0ml，再分别加5%苯酚试液1.0ml并摇匀，迅速加入浓硫酸5.0ml，摇匀后放置10min，置于沸水浴中加热10min，取出流水冷却至室温，另以蒸馏水2.0ml加5%苯酚和硫酸作空白对照，于490nm波长处测吸光度。结果得到回归方程Y=0.0686X-0.0003，r=0.999（Y为葡萄糖浓度，mg/ml；X为吸光度值）。

多糖提取率按如下公式计算：

1.2.2长裙竹荪多糖提取的工艺流程

1.2.2 1样品处理

使用小剪刀将长裙竹荪剪成0.5cm长短的小块在65℃下烘干至恒重，密封备用。

1 2.2.2单因素实验

分别针对料液比、提取时间、不同pH等因素对长裙竹荪进行提取。其中料液比对长裙竹荪多糖提取的影响分别考察（50：1）、（70：1）、（90：1）、（100：1）、（120：1）等5个水平；提取时间对长裙竹荪多糖提取的影响分别考察0.5、1.0.1.5、2.0、2.5等5个水平；不同pH对长裙竹荪多糖提取的影响分别考察pH=6、7、8、9、10等5个水平。

1）料液比

精密称取5份1.0g处理后的长裙竹荪，分别加入蒸馏水50ml（50：1）、70ml（70：1）、90（90：1）、100ml（100：1）、120ml（120：1），在85℃下热回流提取1h，过滤得到5份溶液并定容至250ml。取样品溶液0.2ml.加蒸馏水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入浓硫酸5ml，在80℃水浴中加热10min，取出后置于冷水中冷却，在波长490nm测定吸光度，计算含量（mg/g）。

2）不同提取时间

精密称取5份1.0g处理后的长裙竹荪，分别加入100ml蒸馏水，在85℃水浴下，分别热回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，过滤得到的样品溶液，取样品溶液0.2m咖蒸馏水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入浓硫酸5ml，在80℃水浴中加热10min，取出后置于冷水中冷却，在波长490nm测定吸光度，计算含量（mg/g）。

3）不同pH值

精密称取5份1.0g处理后的长裙竹荪，精密称取5份长裙竹荪1.0g，剪碎，在85℃下，分别加入100ml，pH值为6、7、8、9、10的蒸馏水，提取2h后过滤，得到样品溶液，取样品溶液0.2ml，加蒸馏水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入浓硫酸5ml，在80℃水浴中加热10min，取出后置于冷水中冷却，在波长490nm测定吸光度。测定吸光度，计算含量（mg/g）。

1.2.2.3提取工艺正交设计

在单因素实验基础之上对提取料液比，提取时间.提取pH进行L9（34）正交试验，筛选最优提取工艺。同时对筛选出来的最有提取工艺进行精密度、重复性、稳定性等方法学进行考察。

2.结果

2.1提取料液比对长裙竹荪多糖的影响

以不同料液比提取1次，考察其对提取率的影响.结果见图1。随着料液比升高，竹笋多糖提取率逐渐增大，料液比达到100：1时提取率最高，之后开始下降。由此选择料液比100：1作为最佳料液比进一步筛选其他因素。

2.2提取时间对长裙竹荪多糖的影响

以不同时问提取1次，考察其对提取率的影响，结果见图2。随着时问加长，竹笋多糖提取率逐渐增大，提取时间达到2h提取率最高，之后开始下降。由此选择提取时间2h作为最佳提取时间进一步筛选其他因素.

2.3提取pH对长裙竹荪多糖的影响

以不同pH提取1次，考察其对提取率的影响，结果见图3。随着pH升高，竹笋多糖提取率逐渐降低，提取pH为6.0时提取率最高。由此选择提取pH=6.0作为最佳提取pH。

2.4正交试验

根据正交试验结果，从表2可知极差值中Rc最大为17.15，说明相比较而言pH对长裙竹荪多糖提取率影响最大，其次是提取时间与料液比。最佳提取条件为：料液比（110：1）；提取液的PH值（5.0）；提取时间（2小时），采用此条件下提取，长裙竹荪多糖提取率为（18.65±0.259）%。

2.5重复性与精密度实验

按照筛选出的最优提取工艺分别提取5分样品长裙竹荪多糖液，测定器吸光值。5份样品的吸光度值无显著性差异，RSD为1.512%，表明该方法具有良好的重现性，按照筛选出的最优工艺制备长裙竹荪多糖样品液1份，同时取样5次，紫外分光光度计490nm处测定其吸光度检测精密度，结果表明5个多糖样品液吸光度RSD为1.405%，表明本方法精密度良好。

3.讨论

本实验利用热回流技术探索了提取长裙竹荪多糖的方法。通过正交设计对提取料液比、时间、pH等进行了优化。结果表明pH对长裙竹荪多糖提取具有显著影响，最优提取工艺为：料液比110.1、时间2小时.pH5.0。同时经方法学考察本法有着良好精密度与稳定性。为长裙竹荪多糖在化妆品中的应用提供参考。