乙烯利对泥鳅5种组织酯酶同工酶表达的影响

摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳，在试验水温23～25 ℃的条件下，研究了乙烯利（ETH）对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）5种组织酯酶（EST）同工酶表达的影响。结果表明，经不同浓度乙烯利处理后，在不同染毒时间下泥鳅5种组织EST同工酶酶谱发生了不同程度的变化，变化的类型包括：酶带的缺失、新增及着色的深浅，5种组织EST同工酶的表达具有明显的组织差异性，活性由强至弱依次为：脾脏>肝胰脏>鳃>心脏>肌肉；没有发现剂量梯度与EST同工酶表达的正相关变化，在不同染毒时间下，脾脏、肝胰脏、鳃组织EST同工酶基本上表现为在24 h活性增强，48 h活性达到最弱，72 h略有增强，96 h又减弱，而心脏和肌肉组织24 h先增强，而后一直减弱的趋势，表现出明显的组织差异性和应激性。

关键词：泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）；乙烯利；组织；酯酶；同工酶

中图分类号：X503.225；R155.5 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4325—05

乙烯与果实成熟有着密切的关系，被认为是果实成熟激素。乙烯利（Ethrel，ETH）化学名称为2—氯代乙基膦酸，是一种人工合成的乙烯释放剂，其作为植物生长调节剂具有用量小、见效快、残留少等特点，广泛用于保护地反季节早熟植物栽培[1—3]。近年来，由于存在乙烯利的滥用及随意提高使用浓度、盲目改变使用时间等现象，乙烯利在果蔬中的残留已经成为影响果蔬食用安全的因素之一[4]。另有研究表明[5]，乙烯利具有一定的神经毒性和弱激素样作用。国外对水果、蔬菜中残留的乙烯利有严格的限量要求，欧盟最新规定其最高残留限量为0.02 mg/kg[6]。于文辉等[4]研究表明，乙烯利对小鼠体细胞和生殖细胞具有致突变作用。但关于乙烯利对鱼类组织同工酶表达的影响目前鲜见报道。

同工酶技术可指示一些具有特异性的同工酶带，定性地反映环境中的污染物。酯酶（EST）同工酶能水解大量非生理存在的酯类化合物，包括某些药物，具有解毒作用。在环境毒物存在的情况下，多种动植物EST同工酶的表达都会有显著的变化[7]。环境科学多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究环境污染物对生物同工酶表达的影响[8，9]。本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在水温23～25 ℃的条件下，研究了乙烯利对泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）5种组织EST同工酶表达的影响，旨在为生活生产中合理使用乙烯利提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用泥鳅购自世纪华联超市，选择体格健壮、体表无伤、规格一致的泥鳅，平均体长为（14.56±0.35） cm，平均体重为（27.00±0.26） g。试验前将泥鳅放入曝气自来水中驯养1周，每天换1次水。乙烯利（分析纯）购自上海化学试剂采购供应五联化工厂。

1.2 方法

1.2.1 染毒试验 根据急性毒性试验结果，以96 h全部存活浓度为最低浓度，全部致死浓度为最高浓度，将试验分为3个试验组和1个空白对照组，每组15尾泥鳅。试验组乙烯利浓度依次为0.06、0.07、0.08 mg/L，空白对照组不添加乙烯利。染毒试验在室内容积为10 L的棕色玻璃缸中进行，每个玻璃缸加入相应处理液4 L，对照组加入曝气自来水，每24 h换液1次。染毒时间为96 h。试验期间不投饵，仅用简易增氧机进行增氧，水温23～25 ℃，pH 7.3，发现死亡个体及时清除。

1.2.2 采样 每隔24 h分别从对照组和各试验组随机捞取2尾泥鳅，擦干体表水分，将泥鳅置于盛满冰的解剖盘上解剖，取出心、鳃、脾、肝胰脏、肌肉5种组织，用预冷的无菌蒸馏水冲洗以除去组织血污，然后用滤纸吸去多余水分。分别取上述5种组织称重，将组织放入研钵按1∶2的比例（质量体积比，g/mL）加入0.02 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，置于冰上研磨成糊状匀浆。将研磨好的组织倒入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清液于—20 ℃保存，供同工酶电泳分析用。

1.2.3 电泳 采用周宗汉等[10]的方法制备凝胶，浓缩胶浓度为3.0%，分离胶浓度为7.4%，电极缓冲液为Tris—甘氨酸溶液（pH 8.3）。每孔点样量为10 μL。电泳时，指示剂（溴酚蓝）在浓缩胶内时用70 V电压，当指示剂完全进入分离胶后，将电压升高到150 V，电流控制在15 mA。电泳时间为8 h左右。整个电泳过程于4 ℃进行。

1.2.4 染色 染色液配方参照季维智等[11]的方法。电泳结束后将凝胶取出，用蒸馏水冲洗干净，放入基质染色液中染色，直至清晰条带出现（约5～10 min）。显色完成后用蒸馏水将凝胶冲洗干净，然后用7%的冰醋酸溶液固定、75%的乙醇脱色，数码相机拍照。

1.2.5 同工酶的命名 同工酶酶谱的命名以同工酶缩写名称的大写代表酶蛋白，按从阴极到阳极电泳迁移的方向依次命名。

2 结果与分析

2.1 乙烯利对泥鳅脾脏EST同工酶表达的影响

由图1和表1可见，正常情况下泥鳅脾脏EST同工酶共有4条酶带表达，分别为Est—4、Est—5、Est—6、Est—7，其中Est—4的活性很强，Est—6和Est—7活性较弱。经乙烯利染毒处理后，泥鳅脾脏EST同工酶酶带迁移率（Rf）分布在0.297～0.803，大多集中在0.406～0.495。在不同染毒时间下，3个试验组有2条共有酶带，即Est—4和Est—5。低浓度组（A组）在24 h和96 h时分别有Est—7和Est—6出现，且活性均较弱；在96 h时诱导出Est—2，但活性较弱。中浓度组（B组）在整个染毒过程中均有Est—3、Est—4和Est—5表达，在24 h和48 h时诱导出Est—8。高浓度组（C组）仅在24 h时有Est—6表达，在72 h时诱导出Est—2，但活性较弱。

2.2 乙烯利对泥鳅肝胰脏EST同工酶表达的影响

由图2和表2可见，正常情况下泥鳅肝胰脏EST同工酶有Est—3、Est—4、Est—5共3条酶带表达，三者活性较一致。经乙烯利染毒处理后，低浓度组（A组）各条带表达较好，但是在48 h时条带明显减少并且活性减弱，仅有Est—3、Est—5表达，可能是泥鳅个体差异导致。随着染毒时间的延长，中浓度组（B组）酶带数目趋于增多，并且在96 h时诱导出了惟一的Est—1（Rf =0.382）。高浓度组（C组）EST同工酶活性随着染毒时间的延长逐渐减弱，但在96 h时活性有所增强，可能是肝胰脏EST对高浓度乙烯利的应激作用。总体来说，48 h时3个试验组的酶带最少，颜色较浅，表明酶活性较弱，96 h时酶带最多。

2.3 乙烯利对泥鳅鳃EST同工酶表达的影响

由图3和表3可见，正常情况下泥鳅鳃EST同工酶有3条酶带表达，分别为Est—2、Est—3、Est—4。经乙烯利染毒处理后，随着乙烯利浓度的升高及染毒时间的延长，同工酶条带数和活性发生了一些变化，但条带总体上分布比较集中，Rf在0.410～0.495，部分低浓度组（A3和A4）及全部中浓度组（B组）都诱导出Est—1，其活性被激发，Est—4只在对照组及B3、C3组有表达。泥鳅鳃EST同工酶在24 h时活性逐渐增强，48 h时稍有减弱，到72 h时酶带颜色较深、宽度较宽，酶活性较强，96 h时酶活性又有所减弱。乙烯利对鳃EST同工酶表达的影响主要表现为：在一定浓度下对部分酶带的抑制（Est—4）或诱导（Est—1），其活性变化不大。

2.4 乙烯利对泥鳅心脏EST同工酶表达的影响

由图4和表4可见，正常情况下泥鳅心脏EST同工酶共有3条酶带表达，分别为Est—2、Est—3、Est—4，其中Est—2活性较强。与鳃组织相似，心脏EST同工酶酶带分布也比较集中，Rf在0.363～0.437。低浓度组（A组）在24 h与48 h下表达Est—2、 Est—3两条酶带，在72 h和96 h时诱导出Est—1，但活性较弱。中浓度组（B组）在24 h时诱导出Est—1，且活性较强，在48 h和96 h时均仅有Est—1表达，其他3条酶带缺失。而高浓度（C组）在96 h时诱导出Est—1，且活性很强。从24 h至72 h，心脏EST同工酶活性呈逐渐减弱的趋势，至96 h时活性又有所增强。

2.5 乙烯利对泥鳅肌肉EST同工酶表达的影响

由图5和表5可见，正常情况下泥鳅肌肉EST同工酶共有3条酶带表达，其中Est—2活性很强，推测与心脏一样，肌肉EST的含量也较少。肌肉EST同工酶Rf在0.394～0.500，条带分布较集中。低浓度组（A组）在24、48及96 h时均表达Est—2和 Est—3两条酶带，但在72 h时仅表达Est—4，且活性较弱。中浓度组（B组）在整个染毒过程中均有Est—1和 Est—3表达，且活性较弱；在24 h和96 h时Est—2表达强烈，其活性与对照组相当。高浓度组（C组）仅在24 h时Est—2的活性很强；在72 h时诱导出Est—1，但活性较弱。

3 讨论

EST是生物体内催化羧酸酯类化合物水解和合成的一类酶，具有明显的多态性、高度的组织特异性和种族特异性[7]。EST同工酶是生物体内的天然标记之一。靳晓敏等[12]采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板不连续电泳法分析了高效反式氯氰菊酯和功夫菊酯在不同注射剂量、不同攻毒时间条件下对鲤肝胰脏EST同工酶的影响，结果表明注射不同剂量农药攻毒后，在不同攻毒时间下EST同工酶酶谱发生了不同程度的变化，变化的类型包括：酶带的缺失、新增及着色的深浅，这与本研究的结果一致。本研究表明，对照组除脾脏EST同工酶表达4条酶带外，其余4种组织均为3条，而经乙烯利染毒处理后，各组织EST同工酶表现出明显的组织特异性，根据酶带数目和染色的深浅，各组织EST同工酶活性强弱顺序为：脾脏>肝胰脏>鳃>心脏>肌肉。据此推测，乙烯利对泥鳅脾脏的损害作用最强，对肌肉损害最弱。其中，脾脏与其他组织相比，酶带迁移率极差最大、酶带数目最多、染色最深，表明其活性也最强。尹绍武等[13]对褐点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）不同组织4种同工酶研究发现，肝脏的EST同工酶酶带最多、活性最强。贾秀英等[14]研究了不同浓度的铅对蟾蜍（Bufobufo gargarizans）肝脏、肾脏过氧化物酶和EST同工酶的影响，结果表明不同浓度的铅均可使肝、肾组织过氧化物酶同工酶活性发生明显变化；对肝、肾EST同工酶的影响表现出一定的组织差异性，且在一定范围内主要表现为应激性，即低剂量的铅可诱导酶活性的升高。而本研究发现，脾脏EST同工酶活性在5种组织中最强，其原因可能是由于脾脏参与体液免疫和炎症反应，对内源性或外源性异物进行贮存、破坏或脱毒有关[15]。肝胰脏EST同工酶的酶带集中、染色较深，但酶带数目没有脾脏多，可能是因为肝胰脏是解毒器官，与其解毒功能有关。鳃EST同工酶的表达与肝胰脏相比较弱，但其酶带染色较深、分布较集中。正常情况下，心脏与肌肉都只有3条酶带，且活性较弱。牛红星等[16]研究了毛腿鼠耳蝠（Myotis fimbriatus）不同组织EST同工酶的特异性，结果发现心脏和胸肌仅表达3条相同的酶带，且酶活性相近，推测可能与心脏和肌肉中EST含量较少有关。

王兰等[15]研究了镉对中华绒螯蟹（Sinopotamon yangtsekiense）组织器官EST同工酶的影响，认为其同工酶表达不仅具有组织特异性，而且与积累量有关。而本研究没有发现剂量梯度与EST同工酶表达的正相关变化。在不同染毒时间处理下，心脏和肌肉组织EST同工酶活性在24 h时先增强，而后一直呈减弱趋势，至96 h时活性又有所增强。出现这种情况可能是乙烯利刺激了机体的应激机制，机体通过增加EST酶带数量来增加对抗异物入侵所需的能量，表现出明显的应激性，但机体的应激能力是有限的，当超过其忍受限度时EST同工酶的表达被抑制，至96 h时EST同工酶活性又有所增强，表明机体对环境产生了一定的适应性；而脾脏、肝胰脏、鳃3种组织EST同工酶基本上在24 h时活性先增强，48 h时活性达到最弱，72 h时略有增强，96 h时又减弱，其可能原因与不同组织所执行的生理功能有密切关系。

本试验研究了在外界环境下一定浓度的乙烯利对泥鳅不同组织EST同工酶的影响，乙烯利的浓度为0.06、0.07、0.08 mg/mL，其中0.06 mg/mL与0.08 mg/mL分别为预试验中泥鳅96 h全部存活与全部死亡的浓度，若要得出乙烯利在泥鳅体内的限量，可采用体内注射的方式进一步研究EST活性变化。

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