肾穿刺标本制片的质量控制

文章编号：1009-5519（2007）09-1355-02 中图分类号：R36 文献标识码：B

为提高制片质量，笔者对本科多年肾穿刺标本制片技术和方法进行对比总结，在制片过程中各步骤的质量控制方面采取了一些措施，现介绍如下。

1 标本的固定和保存

1.1 光镜及免疫组化检查标本的固定：选择合适的固定液，及时固定。组织固定是制片的关键，组织干涸及固定不良是染色质量欠佳、脱片的主要原因。首先，将切好的标本应尽快放进固定液里固定，以防止组织的自溶、结构破坏，切勿使其干涸。其次，不同的固定液固定使肾穿刺活检标本切片在不同的镜下观察。因光镜与免疫组化检查共用一份标本，所以在选择固定液时应选择对二者均有良好的染色效果的含有磷酸盐缓冲液的固定液固定。笔者多采用PB-FA固定液进行固定，固定效果好，值得推荐使用。配方：浓甲醛15%，无水乙醇65%，0.05 mol/L pH 7.2-7.4磷酸缓冲液20%。其特点是固定的组织收缩小，肾小管上皮固定良好，无干裂状；组织中的红细胞不被溶解，HE染色及特殊染泽鲜艳，对比鲜明；免疫组化染色阳性信号表达好。常温下固定时间以2小时为佳。

1.2 免疫荧光检查标本的处理及保存：正确的标本处理是荧光标记成功的前提。荧光标本不用任何固定液固定，用冷藏或冷冻法保存。分切后的标本应放置在浸有生理盐水的纱布内并装入小标本瓶，盖好瓶口及时冷藏，以防止组织干涸、溶解破坏，阳性表达减弱；纱布以湿润为佳，不要太湿，以免组织浸泡肿胀而影响观察。分好的标本应立即切片染色为最佳。保存的方法有：（1）不包埋保存：于1个小时内制片的可将标本置于4℃冰箱内冷藏保存；（2）包埋保存：如遇当天不能切片的情况，为避免组织的反复冻溶，组织形态改变，不利于观察，最好的保存方法是将标本包埋在金属支持器上，置于-18℃冷冻保存，保存不应超过2天；（3）切片保存：切好的冰冻切片如不立即染色可将切片放在-18℃保存冷冻2天左右。标本应尽可能在短时间内处理，若时间较长则应置于-70℃的冰箱或液氮罐内保存。

2 包埋、切片

为保证包埋的平整性，石蜡包埋应在石蜡熔融状态时将组织放好压平，然后迅速冷却。肾穿刺组织相对较小，切取最大切面有利于确诊。因此，包埋时应注意将所有的标本包在同一平面，为切片完整及切取最大切面的提供保障。肾小球细胞的数量、种类、基底膜的形态以及免疫复合物等特殊蛋白的有无和沉积部位，对肾小球疾病的诊断至关重要，要求切片厚度应＜3 μm，如切片过厚会造成细胞重叠，导致细胞增生的假象，与邹万忠等报道相同[1]。常规及特殊染色石蜡切片厚度以1-2 μm为适宜，免疫组化染色切片以2-3 μm最佳，且无皱折及刀痕。

荧光染色冰冻切片的制作：将冰冻包埋剂滴在金属支持器上，待其凝固后修平，再将组织摆好压平，并在肾组织上滴加冰冻包埋剂。 冰冻切片厚度适中，以5-6 μm为佳，太薄阳性信号表达弱，太厚可致假阳性，不利于观察及判断。切片机的温度应设置在-20～-22 ℃，温度太高不利于切片，温度太低组织有裂隙，不利于观察。

3 染色

3.1 HE染色：常规HE染色要求红蓝分明，对比清晰，细胞收缩小，透明性好。为此，应使用较新配置的染液，做到深染、分化到位，采用乙醇梯度脱水二甲苯透明封片。

3.2 六胺银染色（PASM）：氧化充分是做好基底膜染色的前提。先用1%高碘酸10分钟，再用5%铬酸40分钟双重氧化更能充分暴露肾小球基底膜上的醛基，基底膜着色更深，且不易脱片。适当温度是六胺银染色必不可少的条件。温度须达60℃组织才起反应，浸染前最好将六胺银溶液先预热，这样可缩短染色时间，减少黑色反光膜的形成及脱片的可能。染色时间和银的浓度是控制染色质量的关键。浸染15分钟后需取出切片在显微镜下观察肾小球基底膜是否呈黑色，不足可继续浸染，直至肾小球基底膜显示清晰即可终止染色。如染色时间过长，组织切片表面会出现的氯化金无法清除的黑色反光膜，切片背景显脏，影响对比染色效果；而染色过短，基底膜着色浅，肾小球基底膜不能清晰显示出来，不利于观察病变。六胺银溶液中银的含量与基底膜着色速度有关，过低则染色时间长，易形成黑色反光膜。

3.3 Masson三色染色：三色染色效果的成败关键在于组织对固定液的选择和显微镜下的调色技术的发挥[2]。高质量的染色应为多种成分显色对比清晰、艳丽，不仅能准确显示肾小球基底膜、基膜基质、胶原纤维和有无免疫复合物的沉积，并且易识别沉积的部位和病变范围。可选用Bouin液在60 ℃水浴温箱浸泡1小时，然后再用2.5%重铬酸钾溶液60 ℃氧化20分钟。

3.4 免疫组化染色：除染色的温度、时间以及抗体的效价外，修复乃免疫组化的重点控制步骤。推荐使用修复方法为高温高压处理与胰酶消化结合的方法，这样可以充分暴露免疫沉积物的抗原位点，提供阳性显色强度。如果单独使用其中一种方法则效果欠佳[3]。胰酶消化乃实验的重中之重。胰酶批号不同，实验室的温度低于20 ℃或高于25 ℃时，消化时间均有所不同，应通过预实验来确定。消化效果以毛细血管内无着色为佳。消化时间过长，肾小球结构遭破坏，不利于观察；时间过短，会造成假阴性，导致误诊、漏诊。一抗浓度及消化时间的确定最好选用狼疮性肾炎标本进行预实验。显色时间与室温、DAB浓度有关，可将DAB浓度稀释至常规浓度的2倍，并随时显微镜观察镜下控制显色进程，以达到最佳显色效果。

3.5 免疫荧光染色：温度、时间、抗体的效价等均会影响荧光的染色效果。切片应选用新鲜冷丙酮进行固定。为消除背景染色，达到最好的染色效果，抗体使用前需确定工作液浓度。荧光试剂最好现用现配，用剩的试剂应在3天内用完。标记好的切片应尽快封片，否则阳性信号会减弱。对于染色后不立即观察的切片须置于4 ℃冰箱内避光保存，应在3天之内观察。由于荧光标本切片组织小且透明，滴加抗体之前，宜用记号笔在玻片的背后将肾组织圈在小范围内，这样既可利于准确滴加抗体，又可镜检时能迅速找到肾组织。

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