固精丹对小鼠免疫机能的影响

摘 要：目的：研究固精丹对小鼠免疫机能的影响，探讨固精丹治疗肾小球肾炎低免疫学机制。方法：采用碳粒廓清实验、迟发型变态反应实验、IgM抗体生成实验，分别检测固精丹对小鼠的细胞免疫和体液免疫的影响。结果：固精丹对小鼠的炭粒廓清实验和迟发型变态反应无明显影响；对IgM抗体的产生有明显的促进作用。结论：固精丹能明显提高小鼠的体液免疫功能。

关键词：固精丹；小鼠；免疫功能

中图分类号：R285.5

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）05-1083-04

Effect of Gujingdan on Immune Function of Mouse

SHANG Mingxiu,CHEN XIUlan，JIN Yun，LIN Li（

Shenyang Medical College,Shenyang110034, Liaoning，China

）

Abstract：Objective：To research the effect of Gujingdan ( GJD) on immune function of mouse to approach immunologic mechanism of Gujingdan which cure glomerular nephritis. Methods:Clearance of iv charcoal particle, the delayed type hypersensitivity and measure the content of IgM are used to detect the effect of GJD on on immunity function of mouse. Results: Gujingdan have not the effect on Clearance of iv charcoal particle and the delayed type hypersensitivity and it promote to produce IgM markedly .Conclusion: Gujingdan possess the function of elevating the humoral immunity.

Keywords：Gujingdan；mice；immunity function

固精丹是中药复方制剂,由黄芪、益智，山药、丹参、淫洋藿、当归等10味中药组成，主要用于治疗肾小球肾炎，临床应用证明固精丹有明显的降低尿蛋白改善肾功能的作用。肾小球肾炎被认为是一种免疫性疾病，外来抗原进入机体，如细菌、病毒、寄生虫的感染，注入异种血清或药物等，自身抗原的产生，如自身免疫性疾病系统性红斑狼疮等，刺激机体产生抗体，抗原、抗体结合形成免疫复合物（IC），沉积在肾小球基底膜，激活补体，损伤肾组织。最终疾病的发展、预后和转归都和机体的免疫功能和状态有关。固精丹能降低尿蛋白，改善肾功能，可能具有干预和/或调节免疫的功能，所以研究固精丹对免疫功能的影响，以期为阐明其作用机制提供佐证，并为肾小球肾炎的临床治疗提供理论依据。

1实验材料

1.1实验动物昆明种小白鼠，雌雄兼用，18～22g，由沈阳药科大学试验动物中心提供，动物合格证号：辽实动字042号；试验前适应性饲养2～3天，自由进食饮水。豚鼠：雌雄兼用，体重300～400g，由沈阳药科大学实验动物动物中心提供，辽实动字042号。

1.2药品与试剂固精丹颗粒剂：辽宁省中医院制剂室提供；环磷酰胺（Cyelophosphamide）:上海华联制药有限公司，批号：040215；肾康宁：芜湖绿叶制药有限公司生产，批号：041238。印度墨汁：北京市西中化工厂生产，批号：030301；2，4－二硝基氯苯（DNCB）：上海试剂总厂生产，批号：2003.07－01；新鲜鸡红细胞：自备。

1.3仪器80－2离心机：江苏金坛大地自动化仪器厂生产；上皿电子天平：上海精密科学仪器厂有限公司天平仪器厂；TG－328B型电子天平：上海第二天平仪器厂；CL－770型半自动生化分析仪：日本岛津制作所。

2实验方法

2.1对正常小鼠免疫器官的影响[1]取18～22g小鼠，雌雄兼用，随机分为5组，每组10只，给药组分别灌胃固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，空白组给予等容量的蒸馏水，连续给药7天，于末次给药后2h，脱颈椎处死，分别取脾和胸腺称重，计算脾指数和胸腺指数。

脾指数＝脾重（mg）/ 体重（g）

胸腺指数＝胸腺重（mg）/体重（g）

2.2 对免疫低下小鼠免疫器官的影响[1]取18～22g小鼠，雌雄兼用，随机分为6组，每组10只，给药组分别灌胃固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，连续给药7天。除空白组外，其余各组均于给药的第3～5天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，于第7天，末次给药后2h，脱颈椎处死，取脾和胸腺称重，计算脾指数和胸腺指数。

2.3对正常小鼠碳粒廓清的影响[2]取18～22g小鼠，雌雄各半，分组及给药同2.1，末次给药后2h，尾静脉注射印度墨汁（1∶3稀释）0.1mL/10g，于注射后2、10min时，眶静脉采血1～2滴，滴于玻片上，用肝素润湿过枪头的移液枪吸30μL血，迅速加到3mL 2％Na2CO3溶液中混匀，以Na2CO3作空白对照，波长680nm处测OD值；然后将小鼠脱颈椎处死，取肝脾称重，计算廓清指数K及校正廓清指数α。

K＝lgOD1－lgOD2 / t1－t2

α＝K1/3×体重/（肝重+脾重）

（OD1、OD2分别为两次采血所测光密度，t1－t2为两次采血的时间差）

2.4对免疫低下小鼠碳粒廓清的影响[4]取18～22g小鼠，雌雄各半，分组及给药同2.2,除正常组外，其余各组均于第3～5天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，于末次给药后2h，尾静脉注射印度墨汁0.1mL/10g，注射后2、10min，眶静脉采血1～2滴，滴于玻片上，用移液枪（枪头用肝素润湿）吸取30μL血，迅速加到3mL 2％NaCO3溶液中混匀，于波长680nm处测OD值；然后将小鼠处死，取肝脾称重，计算K值和α值。

2.5对正常小鼠迟发型超敏反应的影响[3]取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，除空白组外，给药组分别腹腔注射固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，连续给药9天；于给药第4天，各组小鼠均于背部皮下注射7％DNCB丙酮溶液25μL致敏，于致敏后第5天，末次给药后2h，在小鼠的左耳涂7％DNCB丙酮液25μL激发，24h后处死，剪下左右耳重叠在一起，用8mm打孔器打下耳片称重，以两侧耳片的重量差作为评判迟发型超敏反应强度指标。

耳肿胀度（mg）＝左耳片重（mg）－右耳片重（mg）

2.6对免疫低下小鼠迟发型变态反应的影响[3]取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组10只。给药组分别灌胃固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，连续给药9天；于给药第4天，除空白组外，各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续3天；于同一天各组小鼠均于背部皮下注射7%DNCB丙酮液25μL致敏，于致敏后的第5天，末次给药后2h，在小鼠左耳的内外涂抹7％DNCB丙酮溶液25μL激发，24h后处死，剪下左右两耳重叠在一起，用8mm打孔器打下耳片称重，计算耳肿胀的程度。

2.7对正常小鼠IgM抗体产生的影响[4]取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分为5组，每组10只，给药组分别灌胃固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，空白组灌胃等容量的蒸馏水，连续给药7天，于给药的第4天，各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞0.2mL/只致敏，于第7天再次腹腔注射5％鸡红细胞，第2次致敏的第5天，眶静脉采血，分离血清，取血清30μL，稀释600倍；取稀释后的血清0.6mL，加生理盐水0.6mL，5％鸡红细胞0.6mL，10％补体0.6mL，置于37℃恒温水浴中保温1h，取出后3000r/min离心10min，取上清液于540nm波长处测吸光度。

补体的制备：取豚鼠1只，心脏采血10mL，3000r/min离心15min，分离血清，与鸡红细胞压积10∶1的比例加入豚鼠血清，于4℃ 条件下，间歇性混匀10min，然后以2000r/min离心10min，收取上清液既是。用时以生理盐水稀释10倍。

2.8对免疫低下小鼠IgM抗体产生的影响取18～22g小鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，给药组分别灌胃固精丹6、3、1.5g/kg，阳性对照组灌胃肾康宁3g/kg，空白组和模型组灌胃等容量的蒸馏水，连续给药7天，于给药的第4天，各组小鼠均腹腔注射5％鸡红细胞0.2mL/只致敏，除空白组外，并于致敏的当天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续3天；于第7天再次腹腔注射5％鸡红细胞，第2次致敏的第5天，眶静脉采血，分离血清，取血清30μL，稀释600倍；取稀释后的血清0.6mL，加生理盐水0.6mL，5％鸡红细胞0.6mL，10％补体0.6mL，置于3℃恒温水浴中保温1h，3000r/min离心10min，取上清液于540nm波长处测吸光度。

3实验结果

3.1对正常小鼠免疫器官的影响与空白组相比，固精丹高剂量、中剂量、低剂量组及肾康宁阳性对照组的脾指数和胸腺指数均无显著差别，表明固精丹对正常小鼠的免疫器官无显著影响（P

4讨论

固精丹的组方中,黄芪、山药、淫洋藿、杜仲、当归均有调解免疫功能的作用。黄芪总苷对细胞免疫和体液免疫均有一定的增强作用，可明显提高碳粒廓清指数，不仅能增强正常小鼠吞噬细胞的吞噬功能，而且可以减低环磷酰胺对免疫的抑制作用；黄芪总苷也能促进正常小鼠和环磷酰胺抑制小鼠血清溶血素的生成；对DNCB所致的迟发型超敏反应有明显的促进作用；促进ConA对小鼠淋巴细胞的增殖作用。当归能增强机体非特异性免疫功能，促进正常和环磷酰胺抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能；增强细胞免疫，提高小鼠的E－花环形成率及酸性α－萘酚醋酸酯酶染色阳性率；对体液免疫的影响，当归能明显提高羊红细胞（SRBC）抗体溶血素的产生和血清中抗体的效价。对细胞因子白介素（IL－2）和干扰素(IFN)有明显的诱生作用。淫洋藿能明显增加脾脏和胸腺的重量，促进溶血素抗体的生成，提高碳粒廓清指数，增强2，4－二硝基氯苯（DNCB）诱导的耳肿胀反应；淫洋藿总苷具有诱生IL－2、IL－3、IL－6等细胞因子的作用，淫洋藿总黄酮（EF）能明显抑制皮质酮诱导的T细胞凋亡的百分率。山药也能促进小鼠的细胞免疫和体液免疫功能，提高外周血T淋巴细胞的转化率。杜仲对免疫功能具有双向调解作用，抑制DNCB所致的迟发型变态反应，对抗氢化可的松所致T淋巴细胞百分率的降低，明显抑制正常小鼠血清溶血素的形成，但对环磷酰胺抑制小鼠血清溶血素的形成无明显影响。综上所述，中药复方固精丹对机体的免疫功能可能具有一定作用。但中药复方成分复杂，各个成分之间可能会产生协同作用，也可能产生拮抗作用，所以复方的作用和每位单方药的作用有所不同[5]。本次实验结果表明，固精丹对能明显增加免疫低下小鼠脾脏的重量；对细胞免疫的影响较小，对非特异性免疫功能无明显作用，但具有非常明显的增强体液免疫的功能。

固精丹能有效降低尿蛋白，改善肾功能，对肾小球肾炎产生治疗作用，除了其具有抗氧化作用、降低血黏度、抑制细胞因子的表达外，还与其具有调节机体的免疫功能有关。溶血素实验证明，固精丹增加IgM抗体的产生，说明固精丹可能有增强体液免疫功能的作用。机体的免疫系统是保护机体免受致病因子的侵袭和/或协助机体清除抗原和致病因素，促进疾病的康复。一般认为，在肾小球肾炎和其他一些自身免疫反应疾病的发病机制中免疫功能的增强起了至关重要的作用。肾小球肾炎是免疫复合物疾病，属于Ш型变态反应[6]。免疫复合物是否引起组织损伤主要依据免疫复合物分子的大小，而IC分子的大小又取决于抗原抗体的比例，当抗原量过剩时，形成小分子免疫复合物，被肾小球滤过，而不易沉积在肾小球基底膜引发炎症；当抗原稍微超过抗体时，形成中等大小的IC，可随血流沉积在肾小球基底膜上，激活补体引起炎症损伤；当抗体大大超过抗原时形成大分子不溶性的IC被吞噬细胞清除。固精丹能增强机体免疫功能，刺激机体产生大量抗体，可与抗原形成大分子IC，被吞噬细胞吞噬，更有利于IC的清除。如果机体进入或自身存在大量抗原，机体的免疫功能增强，势必引起强烈的免疫反应，造成组织的损伤；当用C-BSA（碳化的牛血清白蛋白）造膜性肾炎模型时，持续大量的抗原进入机体，固精丹刺激机体产生抗体的量还不足以大大超过抗原，所以形成中等大小的IC，沉积在GBM，激活补体引起免疫损伤。所以边造模边给药，尿蛋白不但没降低，反而升高了。当停止造模后，固精丹能迅速降低尿蛋白，说明当外来的抗原减少时，免疫功能增强能产生足够的抗体，形成大分子的IC，有利于吞噬细胞清除。人工复制的肾炎模型与自然病理状态下的肾炎是有差别的，人工复制肾炎模型是人为地短时间给模型动物注入大量的外来抗原，机体产生的抗体还不足以超过抗原形成大分子IC，被吞噬细胞吞噬处理掉，而是形成中分子IC沉积在GBM，引起免疫损伤。而自然病理状态下的肾炎，是由于少量的外原性或内源性的抗原源源不断的产生形成IC，引发机体持续的免疫反应，造成肾组织的损伤。如果增强机体的免疫功能，则有利于迅速清除抗原，避免免疫过程对肾脏的损伤。

肾小球肾炎的传统治疗，一般多采用免疫抑制药或具有免疫抑制作用的中药制剂，比如雷公藤早已被应用于临床治疗肾小球肾炎。但也有用增强机体免疫功能的或具有免疫调节作用的中药制剂治疗的，其机制可能是免疫抑制剂抑制机体产生抗体，使抗原的数量远远大于抗体，形成小分子的IC，被肾小球基底膜滤过，达到清除抗原进而治疗肾小球肾炎的目的；采用免疫增强剂的目的，主要是刺激机体产生大量的抗体，与抗原形成大分子的IC，被机体的吞噬细胞清除掉而达到清除抗原和治疗肾炎的目的。也可能还有其他的机制有待于进一步探讨。

参考文献

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［3］周义乾，刘玉林，刘珍，等.黄芪注射液对肺结核患者T细胞亚群的影响及近期疗效[J].安徽医科大学学报，2003，35（2）：118－120.

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［5］沈自尹.中医药对对免疫功能影响的综述与评价[J] .中国中西医结合杂志， 1992，12（7）：443－446.

［6］龚非力.医学免疫学[M].2版.北京：科学出版社，2004：307－309.