牛肝中牛磺酸对免疫抑制小鼠免疫及抗氧化能力的影响

摘 要：为了研究牛磺酸对动物免疫调节作用和抗氧化能力的影响，本实验通过物理方法从牛肝中提取天然牛磺酸，并对不同年龄的小鼠腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，再给免疫抑制小鼠腹腔注射不同剂量的牛磺酸，并且比较牛磺酸对不同年龄免疫抑制小鼠的免疫调节作用和抗氧化能力的影响，并对免疫指标与总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）进行相关性分析。结果表明：高、低剂量牛磺酸对不同年龄免疫抑制小鼠的免疫调节作用和抗氧化能力均有改善，且幼年组与老年组灌胃牛磺酸的免疫调节作用和抗氧化能力均达到正常水平或优于正常水平，并经相关性分析，小鼠抗氧化能力升高免疫能力也随之升高。

关键词：牛磺酸；环磷酰胺；免疫抑制；小鼠；抗氧化

Abstract： Taurine is one of the conditionally essential amino acids in the human body and it plays an important role in the physiological functions of the human body. In this research， our purpose was to evaluate the effect of taurine on immune functions and antioxidant capacity in animals. A mouse model of immunosuppression was established by intraperitoneal injection of mice of different ages with cyclophosphamide， and then the immunosuppressed mice were intraperitoneally injected with various doses of natural taurine physically extracted from bovine liver. After 12 hours， we measured immunological indicators and antioxidant parameters and correlated immunological indicators with total antioxidant capacity （T-AOC）. The results showed that taurine at both high and low doses had an immunoregulatory effect and improved antioxidant capacity in immunosuppressed mice of different ages and immune functions and antioxidant capacity in juvenile and old mice administered with taurine reached or exceeded the normal level. Correlation analysis revealed that there was a positive correlation between immune functions and antioxidant capacity in mice.

Key words： taurine； cyclophosphamide； immunosuppression； mice； antioxidant

DOI：10.15922/ki.rlyj.2016.11.001

中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）11-0001-05

牛磺酸（Taurine，Tau）又称牛黄酸，是一种含硫的氨基酸，同时也是人体必需的营养素和条件性必需氨基酸之一[1]。经相关研究表明，牛磺酸有增加细胞抗氧化、抗自由基损伤以及抗病毒侵害的能力[2]，还可提高人体的免疫力、改善脂肪代谢、抗氧化等多种功能[3-5]，同时牛磺酸还具有增强视力、加快促进大脑发育、缓解疲劳的功能，另外牛磺酸还有一定的抗肿瘤活性等功能。与此同时，经国内外多项实验表明，牛磺酸对人体健康尤其是对新生婴幼儿听力、身高发育、神经系统、体质量等有着重要作用，但是婴幼儿自身合成牛磺酸的能力又极为有限，因此牛磺酸被广泛添加于婴幼儿乳粉和功能性食品中，以弥补母乳的不足[6]。由于国内外目前牛磺酸的提取存在着成本高、环境污染程度大和回收率低等现象，本实验从牛肝中提取天然高纯度牛磺酸并且较为深入地研究其对人体的免疫功能和抗氧化能力的影响。

近些年来，随着我国肉牛养殖业的迅猛发展以及人们饮食结构的逐渐改变，消费者对牛肉的需求量也日益增加，与此同时其副产物产量也随之大量增加，所以充分合理地利用这些副产品，无疑将成为企业增加效益的另一种重要途径。据调查研究发现，目前从我国对于肝脏的加工利用程度来看，肉牛屠宰后的肝脏大部分作为原料销向市场，只有少部分经过简单加工成饲料等，这样既造成宝贵资源的浪费，又污染了环境[7]。因此，基于国内外从牛肝中提取牛磺酸及对其深入研究的报道极少，本实验以牛肝为原料，采用简单的物理方法，从牛肝中提取天然牛磺酸，并且研究了牛磺酸对不同年龄免疫抑制小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响，这项研究不仅有助于提高肉牛副产物利用率，而且也为国内外今后研究婴幼儿食品、功能性食品及牛磺酸免疫调节剂的开发提供理论和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用牛肝脏 沈阳法库的八家子牧场。

挑选饲养、健康无病状的2 岁左右雪花牛10 头集中屠宰后采集肝脏，洗净、沥干，样品在冷冻状态下带回实验室，于4 ℃条件下保存样品。

实验所用动物：健康的昆明系小鼠，雄性、清洁级 辽宁长生生物技术有限公司；SPF级动物实验室饲料（符合试验室动物饲料相关标准） 沈阳市于洪区前民动物实验室饲料厂。

牛磺酸标准品 盐城捷阳精细化工有限公司；环磷酰胺 山西振东泰盛制药有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化氢酶（glutathione peroxidase，

GSH-Px）检测试剂盒 南京建成生物科技公司；小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）酶联免疫检测试剂盒、小鼠白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）酶联免疫检测试剂盒 美国R&D公司；无水乙醇、活性炭（分析纯试剂） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

WD2102A酶标仪 北京市六一仪器厂；TD6A高速冷冻离心机 德国Ependoff公司；UV-2100紫外-可见分光光度计 上海龙尼柯仪器有限公司；XH-B涡旋混匀器 北京中西远大科技公司；DNP-9162恒温恒湿培

养箱 精宏（上海）试验设备厂；GFL-70鼓风干燥箱 上海书培仪器有限公司；LDZX-30KBS高压蒸汽灭菌锅 上海申安有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 牛肝中牛磺酸的提取及测定[8]

将冷冻的牛肝样品解冻，再除去脂肪结缔组织，称取5.0 g，切碎研磨至糜状，加入20 mL蒸馏水充分混匀。将2 mol/L盐酸溶液加入到磨碎后的组织中，将组织液的pH值调节到5.5左右，再将调节后的组织液转移到锥形瓶中，用脱脂棉塞住瓶口，置于50 ℃水浴锅内，加热24 h后取出锥形瓶，再将温度调节到80 ℃，将锥形瓶放入水浴锅，继续恒温提取60 min后取出、冷却，用细纱布过滤，收集滤液。取上述提取液1.0 mL，加入2.0 mL显色剂并用蒸馏水稀释至8.0 mL，于100 ℃条件下水浴加热20 min，显黄色，冷却至室温，再在413.5 nm波长处检测，测定牛磺酸含量。按照式（1）计算提取率。

1.3.2 实验动物分组[9-10]

清洁级健康昆明种小鼠：21 日龄幼年小鼠、10 周龄中年小鼠和12 月龄老年小鼠各28 只，每组7 只，共4 组。

1.3.3 血样的制备

药物干预12 h后，将实验小鼠处死眼球采血，静置时间约1 h，于3 000 r/min离心10 min，取离心后上清液，迅速转移至-80 ℃冰箱保存。

1.3.4 组织样品的处理

无菌条件下，采用断颈椎方式处死小鼠，迅速取出脾脏、胸腺及肝脏组织，精确称取质量，放入液氮，取出所需组织后，快速转移至-80 ℃冰箱保存。检测时于冰水浴条件下，加生理盐水制得10 g/100 mL组织匀浆液，于3 000 r/min离心10 min取上清液备用。

1.3.5 免疫指标的测定[11-13]

1.3.5.1 脏器指数的测定

胸腺和脾脏指数以胸腺、脾脏的质量与小鼠体质量的比值表示。分别按照式（2）、（3）计算胸腺指数、脾脏指数。

1.3.5.2 免疫球蛋白、白细胞介素-2的测定[14]

免疫球蛋白（IgG）、白细胞介素-2（IL-2）含量的测定按照相应试剂盒说明操作，使用酶标仪于450 nm波长处测定。

1.3.6 抗氧化指标的测定[15-17]

T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px测定按照相应试剂盒说明操作，使用分光光度计于520 nm波长处比色测定。

1.4 数据处理

使用SPSS 17.0/PC统计软件进行分析，结果用平均值±

标准差的形式表示，显著性检验用方差分析（analysis of variance，ANOVA），各组间数据采用最小显著差数（least significant difference，LSD）法进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 牛磺酸对小鼠免疫功能的影响

2.1.1 牛磺酸对小鼠免疫器官指数的影响

Y、M、O分别为幼年组、中年组、老年组。下同。

由图1a可知，幼年组和中年组小鼠注射环磷酰胺后，与空白组比较脾脏指数呈下降趋势，组间数据有显著性差异（P

由图1b可知，幼年、中年和老年3 个年龄小鼠的模型组与空白组比较，小鼠胸腺指数均显著降低

（P

2.1.2 牛磺酸对小鼠血清免疫球蛋白IgG的影响

IgG是免疫球蛋白的最主要的成分，也是血清免疫球蛋白中含量最多的一种[18]。一般情况下，血清免疫球蛋白的含量与年龄有一定关系，机体IgG的含量可表示机体体液免疫水平的高低。对实验小鼠的血清样本进行IgG检测，结果如表2所示。

由表2可知，牛磺酸对小鼠的血清IgG水平具有调节作用，对于中年小鼠，牛磺酸可提高血清IgG水平，但不同剂量对免疫的增强作用无显著差异；对于老年组小鼠，牛磺酸增强免疫力的作用与剂量成正相关；幼年模型组小鼠血清IgG水平升高，而补充一定剂量牛磺酸的小鼠血清IgG含量降低，并趋向于机体正常水平。说明灌胃牛磺酸可以增强机体体液的免疫力，且对免疫的调节是双向的。

2.1.3 牛磺酸对小鼠血清IL-2的影响

由表3可知，各模型组小鼠与空白组比较，模型组小鼠血清IL-2（P

2.2 牛磺酸对小鼠抗氧化水平的影响

由表4～7可知，环磷酰胺可使机体免疫功能受到抑制，导致氧化与抗氧化状态向氧化方向倾斜，诱导机体发生氧化应激，导致损伤机体[20]。小鼠受到免疫抑制剂的刺激后，体内的氧化还原系统失衡，导致T-AOC能力下降，SOD和GSH-Px酶活力降低，MDA含量上升，而灌胃牛磺酸的小鼠T-AOC、SOD和GSH-Px的水平得到提高，MDA含量下降，但不同剂量牛磺酸对不同年龄的影响各不相同。幼年组小鼠灌胃高、低剂量的牛磺酸对机体抗氧化能力的提升效果差异显著，血清中T-AOC水平低于对照组；中年组小鼠两剂量组间抗氧化水平没有显著的差异；老年组小鼠，高剂量牛磺酸对血清中的

GSH-Px、MDA作用效果显著优于低剂量的作用效果。因此，高、低剂量牛磺酸可提高幼年组和老年组的机体抗氧化能力。

2.3 免疫指标与T-AOC的相关性分析

由表8可知，血清IgG与T-AOC存在一定的相关性，幼年组小鼠血清IgG与T-AOC相关性极显著；中年组小鼠血清IgG水平与T-AOC不显著；老年组小鼠血清IgG水平与T-AOC相关性显著。通过相关性分析结果可发现，幼年组和老年组的免疫水平和抗氧化能力有较大的相关性，而中年组相关性较小，可能是由于中年组机体自我调节能力较强，牛磺酸对其影响较弱。

IL-2与T-AOC存在一定的相关性，幼年及老年小鼠IL-2与血清T-AOC相关性显著，中年组小鼠IL-2与其血清T-AOC相关性极显著。通过对免疫指标和总抗氧化能力的相关性分析可以发现，小鼠抗氧化能力升高免疫能力也随之升高。

3 讨 论

本实验通过物理方法对牛肝中牛磺酸进行提取，并测定脾脏、胸腺器官的免疫指标、体液免疫指标血清IgG、细胞因子指标IL-2。结果表明，灌胃牛磺酸可减轻免疫抑制对幼年和中年小鼠脾脏的退化作用，但不同剂量对中年组的效果没有显著差异，牛磺酸可显著抑制老年小鼠的脾脏肥大现象，且高剂量效果优于低剂量。牛磺酸对小鼠的血清IgG水平具有调节作用，对于中年小鼠，牛磺酸可提高血清IgG水平，但不同剂量对免疫的增强作用无显著差异；对于老年组小鼠，牛磺酸的增强免疫力作用与剂量成正相关；幼年模型组小鼠血清IgG水平升高，而补充一定剂量牛磺酸的小鼠血清IgG含量降低，并趋向于机体正常水平，说明灌胃牛磺酸可以增强机体的免疫力，且对免疫的调节是双向的。模型组小鼠血清IL-2水平出现显著降低，而补充牛磺酸的小鼠免疫抑制后IL-2水平没有明显降低，表明牛磺酸可以抵抗环磷酰胺的免疫抑制作用，维持机体免疫功能的稳定，且高剂量效果优于低剂量，但对幼年和中年小鼠两剂量差异不显著；幼年组小鼠灌胃高、低剂量的牛磺酸对机体抗氧化能力的提升效果差异显著，中年组小鼠两剂量组间抗氧化水平没有显著的差异；老年组小鼠，高剂量牛磺酸对其脾脏T-AOC、MDA以及肝脏和血清中的GSH-Px、MDA作用效果显著优于低剂量的作用效果。小鼠的血清IgG、IL-2与T-AOC存在一定相关性。

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