VEGF在卵巢癌组织中的表达及临床意义

[摘要] 目的:探讨VEGF在卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌发生、发展的关系。方法:运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色法检测VEGF在正常卵巢组织及卵巢癌组织中的表达情况。结果:卵巢癌组织中VEGF mRNA表达水平及蛋白阳性率均高于正常卵巢组织(P

[关键词] 卵巢癌;VEGF;逆转录聚合酶链反应;免疫组织化学

[中图分类号] R737.31[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-009-03

Expression and clinical significance of VEGF in ovarian carcinoma

YAN Li'nan1, LI Huiling2, WU Jian1, ZHANG Jisheng2

(1.Department of Clinical Laboratory, Female and Infant Hospital of Jiamusi, Jiamusi 154003, China; 2.Department of Clinical Laboratory, Jiamusi University, Jiamusi 154002, China)

[Abstract] Objective: To explore the expression of VEGF in ovarian carcinomas, and investigate the relationship with oncogenesis and progression of ovarian carcinoma. Methods: The mRNA and protein levels of VEGF in ovarian carcinoma and normal ovarian tissues were detected with reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. Results: The mRNA level and positive rate of VEGF protein of ovarian carcinoma were significantly higher than that of normal ovarian tissues (P

[Key words] Ovarian carcinoma; Vascular endothelial growth factor; RT-PCR; Immunohistochemistry

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的一类肿瘤,卵巢癌诊断时70%已有盆腹腔转移,卵巢癌浸润、转移是造成卵巢癌治疗困难的主要原因。

肿瘤的生长、浸润和转移依赖于血管生成,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知作用最强的促血管生成因子之一,VEGF特异性作用于血管内皮细胞,通过促进内皮细胞增殖、增加血管通透性,以诱导肿瘤血管生成,在肿瘤的发生及发展中起关键作用[1]。

VEGF是一种多功能的细胞因子,能够诱导血管生成,导致肿瘤的生长、侵袭及远处转移。本研究旨在研究卵巢癌患者组织中VEGF的表达特点及其与卵巢癌临床病理参数的关系,探讨其对卵巢癌预后的影响以及与卵巢癌侵袭、转移的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

42例卵巢恶性肿瘤标本来自哈尔滨医科大学肿瘤医院及佳木斯大学附属第一医院妇科住院手术切除的卵巢恶性肿瘤,同时收集10例卵巢癌癌旁组织(离癌灶边缘5 cm以上处)作对照组。患者年龄20～75岁,平均49.2岁。术前均未行放、化疗,手术室内取新鲜离体标本分为2份,一份立即放入液氮中保存,准备做RT-PCR用;另一份标本常规经10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋;按《WHO肿瘤病理学及遗传学分类(2003年)》行病理组织学分类及病理分级,上皮性癌38例,非上皮性肿瘤4例。患者临床分期按国际妇产科联盟(FIGO,1988年)标准,其中,Ⅰ～Ⅱ期10例,Ⅲ～Ⅳ期32例。

1.2 试剂

引物由上海星汉生物科技有限公司合成,VEGF上游引物序列为:5'-GAG GGC AGA ATC ATC ACG AAG T-3',下游序列为:5'-TCC TAT GTG CTG GCC TTG GTG A-3',目的片段长度为258 bp。GAPDH上游引物序列为:5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3',下游序列为:5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3',目的片段长度为482 bp。RNA提取试剂盒购自上海星汉生物科技有限公司。逆转录酶试剂盒为MBI Fermentas产品。VEGF兔多克隆抗体(武汉博士德公司)、SABC试剂盒(武汉博士德公司),实验按试剂盒说明书进行。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR半定量检测mRNA提取组织总RNA,利用逆转录酶试剂盒,取5 μg组织总RNA合成cDNA第一链,操作按说明书进行。取1 μl的cDNA产物加入2.5 U Taq DNA Polymerase、缓冲液及相应的上、下游引物(各10 pmol)于25 μl反应体系内行PCR扩增,同时以GAPDH为内参照。反应条件:94℃预变性5 min;94℃ 30 s,67℃ 30 s,72℃ 45 s,94℃ 30 s,64℃ 30 s,72℃ 45 s,94℃ 30 s,61℃ 30 s,72℃ 45 s,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 45 s,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s,30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像分析系统分析结果,以各基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相对表达水平数值。

1.3.2 免疫组织化学法按照SABC试剂盒的操作步骤进行。结果判定:以细胞质棕黄色染色为阳性细胞。高倍镜下取3个不同视野各计数100个细胞。按无阳性细胞、阳性细胞数50%分为(-)、(+)、(++)、(+++)四级。(++)、(+++)者为免疫组化阳性表达。

1.4 统计学方法

数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,计量资料采用t检验和单因素方差分析,计数资料用χ2检验及线性相关分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 正常卵巢组织及卵巢癌组织中VEGF mRNA的表达

VEGF mRNA(258 bp)、GAPDH(482 bp)与标准分子相对质量条带显示清楚(图1),电泳所得PCR产物经序列测定证实为目的基因。正常卵巢组织VEGF mRNA相对表达量为(0.19±0.12)。卵巢癌组织VEGF mRNA相对表达量为(0.62±0.23),明显高于对照组(P

图1 卵巢癌组织中VEGF琼脂糖凝胶电泳结果

表1 卵巢癌组织中VEGF mRNA相对表达量与

临床病理指标的关系(x±s)

2.2 正常卵巢组织及卵巢癌组织中VEGF蛋白的表达

正常卵巢组织及卵巢癌组织中VEGF蛋白的表达情况见表2、图2,卵巢癌组织中不同临床病理指标间VEGF蛋白表达见表3。

表2 正常卵巢组织及卵巢癌组织中VEGF蛋白的表达情况

3 讨论

实体瘤的快速增长和转移离不开血管生成,其中VEGF发挥重要作用。VEGF是血管内皮特异性的有丝分裂原,对血管内皮细胞的增殖、水解基膜、迁移和血管构建的调控作用较强[2-4]。VEGF可增加血管的渗透性,使包含基质形成因子的血浆蛋白外渗,为肿瘤转移提供基质。恶性肿瘤普遍表现为VEGF的过度表达,VEGF在肿瘤细胞与血管内皮细胞都有明显的阳性表达[5]。

研究表明,VEGF在卵巢癌组织中高水平表达,表达率为77.8%,与盆腔淋巴结的转移呈正相关,提示在肿瘤生长过程中,VEGF表达增加,导致血管形成加快,出现大量结构和功能异常的肿瘤血管,形成转移,其阳性表达率还与肿瘤细胞有丝分裂活性呈正相关,故可将VEGF作为一个反映卵巢肿瘤恶性程度的生物学指标[6-12]。

本研究采用RT-PCR法检测卵巢癌组织和正常卵巢组织中的VEGF表达。结果提示,卵巢癌组织中VEGF mRNA表达量明显高于正常卵巢组织,其表达量随临床分期、淋巴结转移增加而增高。免疫组化法检测到VEGF蛋白在卵巢癌组织中的阳性率显著高于正常卵巢组织。另外,在VEGF mRNA高表达卵巢癌组织中,其蛋白表达水平亦明显升高,VEGF mRNA和蛋白表达具有明显相关性(P=0.011),表明VEGF通过促进血管形成,在卵巢癌发生、转移过程中发挥重要作用。

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(收稿日期:2009-02-03)