柚皮苷促进人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的研究

[摘要]目的：研究柚皮苷对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLCs）成骨分化能力的影响。方法：组织块法培养原代HPDLCs，加入含不同浓度柚皮苷的培养液（100、10、1、0.1、0.01 mg/L），用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测HPDLCs的培养上清液中ALP的活性，用实时定量PCR检测加入柚皮苷后不同时间点（24h、48h、72h），HPDLCs的骨形成蛋白2（BMP2）、I型胶原蛋白（Col I）、骨保护蛋白（OPG）和核因子κb受体活化因子配体（RANKL）的mRNA表达水平的变化。结果：与对照组比较，不同浓度柚皮苷试验组HPDLCs培养上清液中的ALP活性显著增高（P

[关键词]柚皮苷；人牙周膜成纤维细胞；骨形成蛋白2；骨保护蛋白

[中图分类号]R782 Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）03-0355-05

柚皮苷（Naringin）全称为柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，是骨碎补的主要活性成分[1]。Zhang等[2]的研究证实柚皮苷可以促进骨基质干细胞的增殖并且向成骨细胞的分化。牙周膜细胞在牙周组织的再生和修复中起重要作用。最新研究表明，柚皮苷可以促进牙周膜细胞的增殖和成骨分化的潜能[3-7]。然而，柚皮苷通过何种分子途径促进牙周膜细胞的成骨分化尚未见报道。

本研究旨在观察柚皮苷对体外培养的人牙周膜细胞的分化能力的影响，进一步探讨其促进牙周组织改建的分子生物学基础。

1 材料和方法

1.1主要试剂与仪器：柚皮苷（中国药品生物制品检定所，用含10%FBS的DMEM配制，浓度为100、10、1、0.1、0.01mg/L）胎牛血清（FBS， Gibco，美国），DMEM培养基（Gibco，美国），胰蛋白酶（Gibco，美国），双抗 （青霉素100U/L、链霉素100μg/L，Sigma公司，美国），ALP检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），MTT（Sigma公司，美国），二甲基亚砜（DMSO，天津汇英化学试剂有限公司），酶联免疫检测仪（Bio Tek公司，美国）， TRIZOL Reagent（Invitrogen，美国），PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒 （Perfect Real Time，Takara Bio公司）。

1.2人牙周膜细胞的体外培养：牙周组织样本来自于本院口腔科门诊。选取3个健康个体，因正畸治疗需要拔除的正畸牙6颗，平均年龄12～14岁。临床检查排除急性感染、全身系统性疾病史、家族遗传病史、吸烟史、特殊服药史以及牙体及根尖病变。本实验所用牙齿均经过患者本人同意，并签署了知情同意书。原代PDLSCs培养方法参照文献[8]进行，无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织，采用组织块法进行原代培养及常规传代培养。取3～5代细胞用于本实验。

1.3 ALP活性检测：将对数生长的HPDLCs细胞制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔1×104细胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培养24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，再换无血清的DMEM培养液孵育24 h，分别于每孔加入含终浓度为100、10、1、0.1、0.01mg/L柚皮苷的培养液，以不含柚皮苷的培养液作为阴性对照组，每组设4个复孔。于培养后24h、48h、72h，收集上清液，采用ELISA试剂盒检测各组HPDLCs上清液中ALP的浓度，每孔加入ALP反应底物100μl，37℃孵育30 min，0.2 mol/L NaOH 50μl终止反应，在酶联免疫检测仪上410nm波长处测定各孔A值，每个样品重复检测3次，结果取均值，根据标准品的浓度计算ALP的活性（U/ml）。

1.4 总RNA的提取：将对数生长的HPDLCs细胞制成细胞悬液，接种于6孔板，每孔1×106细胞。置于37℃、5%CO2，用含10% FBS的DMEM培养24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞，再换无血清的DMEM培养液孵育24h，分别于每孔加入含终浓度为1mg/L柚皮苷的培养液，以不含柚皮苷的培养液作为阴性对照组，于培养后24h、48h、72h，分别收集细胞，采用酚-氯仿提取法提取RNA，具体步骤按照TRIZOL Reagent产品说明书进行。

1.5 Real-time PCR：将已测得浓度的RNA按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit （Perfect Real Time） 试剂盒反转录cDNA。按照SYBRR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）试剂盒说明书，将cDNA加入扩增体系。使用20μl反应体系进行加样，即：2μl样本DNA，0.5μl正向引物，0.5μl反向引物，7μlDEPC水，10μl SYBR Premix Ex Taq。引物序列见表1。所有测定在7500 Real Time PCR仪（Applied Biosystems，美国）中进行三次。反应条件为：95°C预变性10s 1个循环，95°C （变性） 5s和60°C （退火和延伸） 20s 40个循环。mRNA的相对浓度通过公式x= 2-ΔΔCt计算，其中x =各时间点目的基因经内参β-actin校正后相对于对照24h组的倍数。

1.3统计学分析：所有数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析，结果用x±s表示，组间比较采用重复测量数据的方差分析。

2 结果

2.1 柚皮苷对HPDLCs细胞ALP活性的影响：与对照组比较，24h、48h和72h后，浓度为1、10、100mg/L的柚皮苷可增强HPDLCS的细胞培养上清液中ALP活性（P

2.2 柚皮苷对HPDLCs细胞BMP-2、Col I、OPG、RANKL的mRNA表达水平的影响：将1mg/L浓度的柚皮苷作用于HPDLCs，24h后，BMP-2基因的表达水平显著升高（P

3 讨论

慢性炎症疾病，如风湿性关节炎，牙周炎等，是最为常见的引起骨质破坏的一类疾病。牙周炎所致的牙槽骨吸收是不可逆的，牙周附着也难以完全恢复至生理状态，因而目前临床上仅能控制、但不能根治牙周炎。缺乏疗效确切的阻断牙槽骨吸收、促进牙槽骨再生的药物，是根治牙周炎困难的主要原因。牙周膜细胞是具有多种生物学功能和分化潜能的细胞群，能够维持牙周膜功能的稳定，在维持正常的牙周组织更新和牙周炎症组织损伤修复中起到了重要的作用。如何促进来源牙周膜的细胞向形成牙槽骨、牙周膜和牙骨质的方向分化，重建牙周组织，是牙周病治疗研究中的热点问题之一。

中药是我国传统医学的瑰宝， 是潜在的新药来源。从疗效可靠的骨伤科常用中草药中筛选抑制骨吸收、促进骨再生的有效成分，是寻找治疗牙周炎新药的途径之一。近期的研究[3]表明，骨碎补的活性成分柚皮苷可以促进牙周膜细胞的增殖，蛋白质合成增加，细胞代谢更旺盛，功能更活跃。ALP是成纤维细胞前体细胞成骨样细胞分化成熟的重要标志，其活性高低可反映不同组织、细胞的矿化能力和向成骨方向转化的趋势[9]。本研究进一步证实24h、48h和72h后，浓度为1、10、100mg/L的柚皮苷可增强HPDLCS的细胞培养上清液中ALP的活性，呈时间依赖性，且最适浓度为1 mg/L。牙周膜细胞分泌大量的I型胶原，I型胶原也是骨基质的主要成分，其在细胞内的表达强度反映了细胞的矿化状态。因此，对于衡量HPDLCS的成骨能力，I型胶原的合成是一个非常重要的指标。本研究证明柚皮苷促进了HPDLCS的I型胶原的基因表达，可见柚皮苷参与调节了HPDLCS的骨代谢。

BMPs是最早发现的具有诱导骨形成作用的细胞因子，BMP-2作为TGF-β超家族中的成员，有很强的促进成骨细胞分化功能。Wong等[10-11]的研究表明，柚皮苷和胶原支架的联合应用可以促进兔颅骨缺损的快速修复，表现为成骨细胞中BMP-2表达增加，从而促进周围新骨生成，这种作用与其HMG-CoA还原酶抑制作用有关。进一步的研究[12-14]表明柚皮苷可以促进培养的成骨细胞的增殖、分化、矿化以及BMP-2的表达，并且通过PI3K和Akt信号通路来调节。我们的研究证明柚皮苷加入后，24h起即显著促进了HPDLCs的BMP-2基因的表达。

OPG/RANKL系统是调节骨代谢的核心因子，OPG通过对破骨细胞调控（抑制破骨细胞的形成和活性） 从而发挥着重要作用，RANKL是诱使破骨细胞分化和激活的关键因素，它可促使破骨细胞前体融合为多核细胞并活化为破骨细胞，并能抑制破骨细胞凋亡，从而最终导致骨吸收。OPG通过竞争性结合RANKL而阻断RANKL与其受体RANK的作用以达到护骨作用[15]。因此局部微环境中RANKL和OPG 表达的相对水平是决定破骨细胞形成及其活性的关键，若OPG基因表达水平高于RANKL，则破骨细胞形成受抑，相反则破骨细胞形成活跃。本研究表明，柚皮苷作用48h后，HPDLCS的OPG基因的表达显著上升，而RANKL基因的表达没有显著变化。OPG/RANKL的比值在48h和72h均显著增高，柚皮苷通过促进OPG的表达来上调OPG/RANKL的比值从而起到促进HPDLCS的成骨基质分泌的作用[16]。

本实验通过体外细胞培养进一步证明，骨碎补中的有效成分柚皮苷通过上调I型胶原，BMP-2，OPG的表达，从而增强了HPDLCs的ALP的活性及成骨代谢能力。

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[收稿日期]2012-11-25 [修回日期]2013-02-02