SD大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立

【中图分类号】 R331 514 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2006)-08-0676-06

摘要 目的 探索SD大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型制作的试验方法与技术。方法 采用完全福氏佐剂－脑脊髓匀浆，并辅以注射百日咳疫苗诱导SD大鼠EAE模型，比较不同的免疫原（同种或异种），注射方法（一次或多次注射）以及性别差异对模型制作的影响。观察和比较动物的神经症状和病理改变。结果 使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠诱导的模型，其发病持续时间分别为16～20天，10～14天；发病率为85％；复发率为46 67%，而致死率仅有5 88％；明显优于其他组别。病理学证实发病大鼠具有典型的脱髓鞘改变和胶质结节形成。结论 使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠诱导的动物模型其临床表现、病理特征、病程特点与人类的多发性硬化（MS）具有很大的相似性，适用于MS的研究。

关键词 实验性变态反应性脑脊髓炎；SD大鼠；动物模型

The establishment of experimental allergic encephalomyelitis model in SD rat

Zheng JianZheng,Gao Cong,Xie FuHua,et,al

The Second Afficiated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangdong,510260,China

Abstract Objective To explore the experimental method and technique of making experimental allergic encephalomyelitis model in SD rat Methods The animal model was established in SD rat by injecting spinal cord homogenate in Freud's complete adjuvant and bordetella pertussis vaccine(BPV)We had used different methods such as homologous or heterologous homogenate, one or multiple injections, and different rats to establish animal modelIts clinical symptoms and histological alteration was observed and comparedResultsThe animal model by injecting homologous homogenate twice in female SD rat is better than other, whose duration of paralysis is 16～20 days，and incidence 85％, incidence of relapse 46 67%，and fatality rate 5 88％We could find many demyelinated lesions in the brain and spinal cord in animal like human with multiple sclerosis(MS)Conclusion The animal model of EAE induced by injecting homologous homogenate twice in female SD rat bears a resemblance to the features of MS, and might be a better model for the study of multiple sclerosis

Key Words Experimental allergic encephalomyelitis; SD rat; Animal model

实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis, EAE）是实验敏感动物发生的,由同种型，同种异型，异种异型致脑炎抗原诱导产生的，由细胞免疫反应介导的，以中枢神经系统白质脱髓鞘性为特征的迟发型超敏反应性自身免疫疾病。EAE具有与人类多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）极为相似的临床，生化，免疫及病理特征，是研究MS理想的动物模型。文献报道的制备EAE模型的方法很多，其敏感品系多为啮齿类动物，如Lewis大鼠，SJL小鼠，PJ小鼠等。用大鼠制备EAE，具有很多优点，如大鼠在同一品系中个体间差异较小，繁殖快，饲养方便等，而且鼠EAE的临床症状和病理变化与多发性硬化较为相似。但国内由于缺乏相关的敏感品系，我们尝试用国内常见的非敏感品系SD大鼠建立EAE模型。

1 材料和方法

1 1 材料

1 1 1 实验动物 SD大鼠雌性90只，雄性20只,8～10周龄，体重200～230g （广东省实验动物中心提供）。

1 1 2 试剂及免疫原 自备SD大鼠脊髓脑匀浆(SD spinal cord homogenate, SD-SCH)，自备牛脊髓脑匀浆(bovine spinal cord homogenate，BSCH)，自备福氏完全佐剂（Freud's complete adjuvant) ；福氏不完全佐剂（北京鼎国公司)，卡介苗100mg/ml(上海生物制品所)，百日咳杆菌2 x 1010个菌体/ml (上海生物制品所)。

1 1 3 主要仪器 微量震荡器(马来西亚IKA公司);Olympus New vanox多功能显微镜(日本Olympus公司);G S-6R Centrifuge冷冻离心机(美国Beckman公司)

1 2 方法

1 2 1 SD大鼠脊髓脑匀浆（SD-SCH）制备 用过量的10％水合氯醛腹腔注射SD大鼠致死，取脊髓及大脑称重。按1g大鼠脊髓及大脑白质加1ml PBS的比例，在冰浴中用电动匀浆机（3000r/ min），将其匀浆3min（每匀浆1min，间隔1min），制成大鼠脊髓脑匀浆。将该匀浆与等体积的完全福氏佐剂（CFA）充分混匀制成诱导乳剂。

1 2 2 牛脊髓脑匀浆（BSCH）制备 方法同上。

1 2 3 福氏完全佐剂（Freud's complete adjuvant，CFA)制备 按1 5ml不完全福氏佐剂，0 5ml卡介苗（100mg/ml）的比例制备CFA。

1 2 3 EAE模型的制备 实验组按不同比例于每只大鼠双后足垫皮下注射含有不同免疫原的CFA，并于大鼠后足垫背面真皮内辅以注射0 2ml百日咳杆菌（2 x 1010个菌体/ml），正常对照组用PBS与CFA等量混合后注射。各实验组别，免疫原，剂量及注射次数如表1。致敏当日计为第0天。致敏后常规饲养各实验组和对照组，每日称其体重。表1 实验组别、免疫原、剂量及注射次数

GroupnGenderImmunogenDosageTimes of Injection＊A（PBS）10PBS0 1ml/100g1B(1BSCH, )20BSCH0 1ml/100g1C(2BSCH, )20BSCH0 06ml/100g2D(1SD－SCH, )20SD－SCH0 1ml/100g1E (2SD－SCH, )20SD－SCH0 06ml/100g2F (2SD－SCH, )20SD－SCH0 06ml/100g2*The second injection was the seventh day after the first one

1 3 临床评分[1] 大鼠被致敏后，每日采用盲法由两名观察者按EAE症状评分标准对大鼠进行功能评分：0分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分：双后肢无力，被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分：濒死状态或死亡。症状介于两者标准之间者以±0 5计。另外，“平均最高临床分值”由在发病期间，组内动物最高分值的总和除以动物数目获得，“每日临床积分均值”由当日该组动物临床积分的总和除以动物数目获得（死亡动物不重复计分）。

1 4 病理取材 各实验组在发病高峰期及恢复期取1只大鼠处死做病理组织学检查。对照组大鼠也分别在相应时间点各取1只做病理学检查。其余动物在实验开始后的第70天处死。

1 4 1 组织病理切片制作 采用10％水合氯醛麻醉动物，先用生理盐水左心室冲洗，再用4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓及脑组织固定于多聚甲醛中，脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片后，常规HE染色、尼氏染色，髓鞘特殊染色（砂罗铬花青法），进行光镜检查。

1 4 2 电镜切片制作 麻醉动物，常规生理盐水冲洗后，滴注电镜预固定液（1％戊二醛，4%多聚甲醛，0 1M PBS混合液，PH 7 2～7 4）, 取脊髓及脑组织(每块大小约1mmx1mmx1mm)放置于固定液过夜，次日取出，过饿酸，梯度酒精，丙酮，包埋。

1 5 MRI 扫描 将评分为4分的动物麻醉后，使其接受0 5T MRI 扫描，分别获得准T1，T2加权像。

1 6 统计学处理 各组数据用t检验，结果以±s表示，P值

2 结果

2 1 临床症状 各组动物均在致敏后第1、2天出现体重减轻，之后逐渐增加并于发病前趋于稳定。A组（PBS）观察70d未出现临床症状（图1）。其他各组大鼠于发病前体重突然下降，随着临床症状的出现，体重下降程度和临床症状严重程度相一致；随着病情的缓解体重逐渐增加。其出现的临床症状主要表现为程度不等的食欲不振、活动减少、体重下降、尾巴无力、松弛、下垂；步履蹒跚、后肢无力、麻痹等，严重者可出现濒死状态，甚至死亡。B组（BSCH,）动物呈明显的急性单相病程，致敏后第8天部分大鼠开始发病，发病率达50％（10/20）。临床症状急、重：多在发病后2天内达到高峰，其中，7只在高峰期死亡。观察70天无复发过程（图2）。

C组(2BSCH,)和E组(2SD-SCH,)两组动物呈明显的双相病程，具有缓解－复发的特点，C组在致敏后第10天部分大鼠开始出现症状，到第12天共有13只大鼠发病，发病率为65％(13/20)。临床症状相对较重，其中临床评分超过4分有9只，3只死亡。随后进入缓解期。在间隔5～8天后有3只(复发率为33 33%)再次出现症状。第二次发病较第一次轻，但是高峰期临床评分仍然可达2～3分，持续时间达7～10天。E组在致敏后第13～15天共有17只大鼠发病，发病率为85％。临床症状中等，发病后4～6天内达到高峰，死亡1只，其临床症状持续时间较其他组长。间隔12～15天后有7只出现再次发病症状，复发率高达46 67%，持续10～12天后进入第二次缓解期（图1）。E组的临床评分与B,C,D组比较均有统计学意义（P＜0 05），其中与B,C组的比较有显著性（P＜0 01）表2。

D组(1SD-SCH,)和F组(2SD-SCH,) 两组大鼠呈不明显的双相病程，缓解－复发的特点不象C组和E组明显，其起病速度，程度介于B组和E组之间。D组在致敏后第11～14天有7只大鼠发病，2只死亡，发病率为35％(7/20)。在间隔5天后有1只再次出现症状，但症状变化不明显，临床评分仅从原来的1 5分变为2 5分。F组在致敏后第12～17天共有10只大鼠发病，死亡2只，发病率为50％(10/20)。间隔7～10天后有2只出现再次发病症状，复发率达到28 57% (2/7)，但临床症状提高也不显著，一只提高了1 5分，一只提高了1分。持续7～9天后进入第二次缓解期（图2）。D组与F组两组间的临床评分比较无统计学意义（P＞ 05）表2。表2 各组EAE的发病情况 n(%)

2 2 组织病理学表现 对照组A组（PBS）的病理检查未见异常，与临床符合,而实验组则出现以下各种改变。

2 2 1 光镜所见 各实验组动物的病理改变主要表现为血管炎伴周围髓鞘脱失，主要病变包括：①血管“袖套样”改变（图3），小血管尤其是小静脉周围有大量炎性细胞密集环绕而成，呈“袖套样”；②胶质细胞结节，可见多个由于胶质细胞增生而形成的结节。③脱髓鞘改变（图4），髓鞘染色可见大小不等的片状脱髓鞘区；④神经元变性，尤其是脑干或脊髓的神经元胞体明显增加，形态圆顿，胞核偏位，核仁消失，尼氏体崩解为细胞颗粒状或完全消失，胞浆着色浅淡；⑤卫星现象，由胶质细胞和中性粒细胞围绕变性的神经元所形成的现象；⑥格子细胞，在炎性病灶内有大量格子细胞，它是由小胶质细胞增生，吞噬髓鞘的破坏产物类脂质和中性脂肪而形成。

EAE大鼠病灶主要侵犯大脑及脊髓的白质以及灰白质交界处，皮质及皮髓质交界处甚至深部髓质，脑脊膜和侧脑室周围也被累及。病灶也侵犯小脑，脑干和视交叉，这与观察到的共济失调，抽搐等临床表现相一致。

值得注意的是B、C两组动物炎症反应较重而脱髓鞘较轻，在B组甚至未发现脱髓鞘病灶。而D、E、F组的炎症反应较轻而脱髓鞘较重，特别是E组第二次发病后的动物炎症反应不明显，但可见散在的大量的脱髓鞘病灶，血管周围胶质细胞增生。

图3 血管“袖套样”改变 图4 脱髓鞘改变

2 2 1 电镜所见 病变散在分布，组织间隙尤小血管周围明显水肿，血管内皮细胞线粒体肿胀，紧密连接处模糊不清。血管腔外分布多个游走的淋巴细胞和单核细胞。实质内淋巴细胞胞浆增多并伸出突起，成为激活的淋巴细胞。可见激活的淋巴细胞贴近神经元，周围组织疏松、水肿。髓鞘呈松散的层状结构，有脱失及融合，明暗相间消失。轴索内线粒体肿胀，微管结构模糊不清，或细胞器完全消失。神经元胞浆内结构松散，内质网扩张脱颗粒，神经元变性。同一髓鞘的内板层松解和轴突髓鞘分离。

2 3 影像学表现 MRI扫描发现动物模型的病灶多分布于脑室周围，病灶大小不一，边缘稍模糊，散在长椭圆性长T1长T2异常信号影，可有明显占位效应。这与人类MS的影像学改变有相似之处，说明了该模型的可靠性。

3 讨论

3 1 实验动物品系的探讨 不同种类的动物对EAE的易患性是不同的，现公认对EAE敏感的品系有Lewis大鼠，DA大鼠等，但是，国内缺乏这些敏感品系，且价格昂贵，这就给国内研究者带来极大的不便。此外，Lewis大鼠，DA大鼠虽属于自身免疫疾病易感动物，但是许多文献表明使用不同的方法诱导此两种敏感大鼠，其临床症状可存在明显的差别。如MBP73～86和MBP87～99对于Lewis大鼠是致脑炎因子，然而用在DA大鼠则不发病。另一方面，Lewis大鼠需要使用诱导DA大鼠2倍剂量的MOG才能发病，且发病率低，发病时间晚[２-３]。所以，有些学者认为，诱导EAE模型需要考虑大鼠对应的敏感的免疫原，而不是单单考虑品系问题。基于以上的原因，国内已有学者尝试使用非敏感系的Wistar大鼠诱导EAE，但报道的EAE发病率差异较大，如马太花等报道的Wistar大鼠EAE模型的发病率达91 3％[４],而彭津平等的报道则仅有30％[５]。此外，国外有文献报道Wistar大鼠经常会对由动物MBP诱导的EAE有耐受现象，表现为不发生EAE或产生的症状不明显，且易于缓解[６]。本实验使用国内常见的另一非敏感系SD大鼠，尝试使用不同的免疫原，不同的注射方法成功的诱导出缓解－复发型的EAE模型，其中，E组(2SD-SCH,)采用同种脑脊髓匀浆，两次注射雌性SD大鼠，其发病率为85％，复发率为46 67%，而致死率仅有5 88％，具有更广的应用前景。

3 2 免疫原的选择 目前诱发EAE模型的免疫原可分为两大类：第一类为人工合成的各种髓鞘蛋白，如MBP，PLP，rMOG等；第二类为自提取的同种或异种脑脊髓匀浆。人工合成的髓鞘蛋白价格昂贵，试验成本高，而自提取的脑脊髓匀浆取材容易，制作简单，价格便宜。本研究使用自提取的同种和异种脑脊髓匀浆诱发EAE模型，并取得成功。本实验所采用的两种免疫原分别为同种的SD大鼠脊髓脑匀浆(SD spinal cord homogenate, SD-SCH)和异种的牛脊髓脑匀浆(bovine spinal cord homogenate，BSCH)。本实验研究发现使用异种脑脊髓匀浆诱导的EAE动物模型表现为一种超急性的炎症反应，临床症状急，重，致死率高，且不易诱发缓解－复发型EAE。B组（BSCH,），C组（2BSCH,）两组动物分别在2天，2～4天内达到高峰。其中B组的死亡率高达70％，是各组死亡率中最高的，而无复发现象。另一方面，同种脑脊髓匀浆诱导的EAE动物模型临床症状持续时间长，发病率、复发率高，而致死率低，较异种脑脊髓匀浆诱导的模型可靠，稳定。如E组(2SD-SCH,)两次的发病持续时间分别为16～20天，10～14天；发病率为85％，复发率为46 67%，而致死率仅有5 88％。从病理改变来看，异种脑脊髓匀浆诱导的动物模型主要以血管周围炎症及炎性细胞浸润为主，鲜少见到脱髓鞘现象，而同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型则正好相反。可见，从临床症状及病理改变来看，同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型更接近人类MS的发病特点。

3 3 注射方法的对比 诱发EAE动物模型有一次注射和多次注射两种注射方法，不同的注射方法，不但可以影响EAE的发生率，还可影响其发展和转归，有报道认为诱发多次注射易引发免疫耐受。本研究采用大剂量(0 1ml/100g)一次注射和中等剂量（0 06ml/100g）多次注射两种方法，发现多次注射诱导的大鼠并无免疫耐受的情况，而且其表现为急性起病后缓解－复发病程特点，这也是一次注射诱导的大鼠所没有的。如本实验中用多次注射法诱导的C组(2BSCH,)的复发率（33 33％）和E组(2SD-SCH,)的复发率（46 67％），就分别比一次注射法诱导B组（BSCH,）的复发率（0％）和D组(1SD-SCH,)的复发率（25％）高。其具体的机制，尚不清楚。然而，目前普遍认为MS及EAE活动期存在血－脑屏障的损害[7]。一旦血－脑屏障遭到破坏则不能维持CNS的自稳状态，也为CNS和外周免疫系统之间的接触提供了可能，这可能是多次注射组的复发率高于一次注射组的原因。

3 4 动物性别对模型建立的影响 国内外研究表明，许多动物都可用于建立EAE模型，但发病都存在性别差异[8-9]。Palaszynski KM等采用脑脊髓匀浆免疫SJL雌雄小鼠，结果雌性发病，雄性不发病，而用PLP139－151免疫则雄性表现为单时相病程而雌性呈现为缓解－复发的特点[９]。本研究发现E组()动物的发病率、症状持续时间、复发率都较F组()高，而死亡率又较F组()低，表现为明显的缓解－复发的临床过程，与相关报道相符。目前对于EAE/MS性别差异的机制仍不清楚，普遍认为EAE/MS是一种CD4＋(Th)细胞介导的炎性脱髓鞘疾病，维持Th1和Th2反应以及与之有关细胞因子的适当平衡是EAE/MS发生和转归的关键。由此推测，EAE的性别差异可能与淋巴细胞亚型及其分泌的细胞因子有关。Palaszynski KM等的研究也发现雄鼠T细胞产生Th2类型细胞因子，而雌鼠产生Th1类型细胞因子[9]。

3 5 病理改变的探讨 传统认为MS是以白质病变为特征的脱髓鞘性疾病，不存在皮质的改变。而近年来的研究发现MS患者发病时除了存在白质病灶之外，可同时出现皮层的病理改变[10]。与报道相符，作者在本实验建立的EAE模型中发现大鼠皮层也出现炎性细胞侵润等特征性的病理改变，这表明MS确实是以脑和脊髓白质病变为主累及皮质的脱髓鞘性疾病。此外，前面我们提到本实验中采用异种脑脊髓匀浆诱导的动物模型如B、C组动物的病理改变主要以血管周围炎症及炎性细胞浸润为主，现少见到脱髓鞘现象；而同种脑脊髓脑匀浆诱导的动物模型如D、E、F组则正好相反，特别是E组第二次发病后的动物炎症反应不明显，可见与人类MS相似的脱髓鞘病灶，血管周围胶质细胞增生,甚至能看到噬神经现象[11]。由于此研究只是对EAE病理改变的初步观察，对于不同组所见到的模型之间病理变化的差别目前只能推测与免疫原的不同，病变过程等因素有关，详细的病理机制未见相关报道，尚待进一步探讨。

在EAE动物模型的建立过程中，EAE大鼠的临床经过与动物品系、性别，免疫原的选择，注射方法等诸多因素有关，重要的是通过实验，对各方面因素进行合适的调整，建立一个理想的、稳定的、动物模型以利于后期研究。我们通过多次的探讨，摸索和改进，发现使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠，辅以同时皮内注射0 2ml百日咳杆菌（2 x 1010个菌体/ml），可以诱发稳定，可靠的EAE模型，其具有缓解－复发病程，与MS相似的的病理改变，能很好模拟人类MS的发病过程。该方法具有简单、经济、可靠，稳定；高发病率、高复发率、而死亡率低等特点，是一种很好的EAE模型诱导方法，适于在国内开展。

参考文献

［1］ Ahn M, Kang J, Lee Y, et alPertusis toxin-induced hyperacute autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats is correlated with increased expression of inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor alpha［J］Neurosci Lett, 2001, 308(1):41-44

［2］Reynolds R, Dawson M, Papadopoulos D, et alThe response of NG2-expressing oligodendrocyte progenitors to demyelination in MOG-EAE and MS［J］J Neurocytol, 2002,31:523-536

［3］Stepaniack JA, Gould KE, Sun D, et alA comparative study of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis and DA rats［J］J Immunol, 1995,155:2762-2769

［4］ 马太花，武慧丽，辛静敏，等 减毒百日咳杆菌对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠模型诱导的影响［J］ 实用医技杂志，2004，11：1710－1711

［5］ 彭津平，邱一华，程纯，等 不同种系动物诱导实验性变态反应性脑脊髓炎模型的研究［J］ 南通医学院学报，2000，20(1):22-24

［6］Rivero VE, Riera CM, Roth GAHumoral response against myelin antigen in two strains of rats with difference susceptibility to experimental allergic of encephalomyelitis(EAE) ［J］Autoimmunity,1999, 29(2):129-137

［7］ Dietrich JBThe adhesion molecule ICAM-1 and its regulation in relation with the blood-brain barrier［J］J Neuroimmunol, 2002,128(1-2):58-68

［8］ Palaszynski KM, Loo KK, Ashouri JF, et alAndrogens are protective in experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for multiple sclerosis［J］J Neuroimmunology, 2004,146:144-152

［9］ Voskuhl RR, Palaszynski KMSex hormones in experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for multiple sclerosis［J］Neuroscientist, 2001,7:258-270

［10］ Bjartmar C, Wujek JR, Trapp BD, Axonal loss in the pathology of MS: consequences for understanding the progressive phase of the disease［J］J Neurol Sci, 2003, 206:165-171

［11］Kuhlmann T, Lingfeld G, Bitsch A, et alAcute axonal damage in multiple sclerosis is most extensive in early disease stages and decreased over time［J］Brain,2002,125(Pt 10):2202-2212