双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮的工艺优化

【摘要】雄烯二酮（AD）是制备甾体激素类药物不可替代的中间体。本文在基于15L小试发酵规模上，优化大豆油/水双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮（AD）的工艺。研究了大豆油在发酵液中的最佳比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性剂对提高植物甾醇转化率的影响，得到最佳转化工艺条件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐温-80，转化96h，植物甾醇最终转化率为87.3%。

【关键词】双相系统；分枝杆菌；雄烯二酮；植物甾醇；表面活性剂

雄甾-4-烯-3，17-二酮（androst-4-ene-3，17-dione，简称AD），是制造甾体激素类药物合成的关键中间物质之一，几乎所有的甾体激素药物都是以AD作为起始原料进行生产的[1]。目前国内主要从野生中药材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂苷元后经化学合成而成，工艺十分复杂，成本很高，而且污染环境[2]。

微生物降解甾醇的工作开始于20世纪60年代，已发现多种微生物可将植物甾醇侧链选择性的切除得到AD[3]。微生物法生产AD主要受甾醇在水中溶解度低的限制，甾醇在水中的溶解度低于2mg/L，产物AD在水中的溶解度也不高于50mg/L[4]，甾体化合物的难溶性是限制微生物转化工业化最主要的障碍之一。传统的单水相发酵多采用添加少量有机溶剂、表面活性剂的方法来提高甾醇在发酵液中的溶解度，效果并不理想，而且有机溶剂等对细胞产生毒性以及对安全、环保等因素影响，从而制约了其在工业化上的应用。采用大豆油/水双液相发酵系统，可以有效增加甾醇的溶解度，提高底物投料量，而且减少了对细胞的毒性。本文主要研究了大豆油在发酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性剂对植物甾醇转化率的影响。

一、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

分枝杆菌Mycobacterium sp-XHL-501（上海新华联制药有限公司菌种室保藏）。

1.1.2 试剂

甾醇为进口甾醇，大豆油购于上海良友海狮油脂实业有限公司，吐温80购于上海申宇医药化工有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

斜面培养基（g/L）：牛肉膏5；胰蛋白胨10；葡萄糖25；琼脂20，灭菌后pH6.8-7.2。

种子培养基（g/L）：葡萄糖 8；玉米浆 65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，灭菌后pH6.8-7.2。

转化培养基（g/L）：大豆油200；甾醇15；玉米浆65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，吐温80 1.5，灭菌后pH6.8-7.2。

1.2 仪器设备

美国安捷伦1260高效液相色谱仪；上海国强生物工程有限公司3L玻璃发酵罐、15L不锈钢立式发酵罐。

1.3 方法

1.3.1 斜面培养

将菌种接种到斜面培养基，30℃培养箱内培养3天。

1.3.2 种子培养

将3L发酵罐内装入2L培养液，121℃灭菌30min，灭菌后pH6.8-7.2。30℃接入斜面种子，搅拌速度200r/min，培养48h左右移种。

1.3.3 发酵转化培养

将15L发酵罐内装入10L培养液，121℃灭菌30min，灭菌后pH6.8-7.2。30℃时以10%接种量接入种子液，初始搅拌速度200r/min，24h后逐渐提高转速至500r/min，用65%磷酸维持pH8.0，发酵转化96h。

1.3.4 转化率计算方法

发酵完成后，取2ml发酵液以体积比1：1加入乙酸乙酯萃取，取上清液稀释100倍，进高效液相色谱仪。色谱条件：柱，流动相甲醇：水=65：35，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长240nm，进样量20μL。

二、结果与分析

2.1不同比例的大豆油对甾醇转化率的影响

大豆油对甾醇及AD均有较好的溶解性，在增加底物浓度的同时对细胞的毒性又较小，而单纯的提高大豆油比例也会破坏油/水双相平衡，影响细胞的生长代谢，同时也会造成生产上的浪费生产成本的增加。根据文献及相关试验摸索，如表1所示，大豆油含量20%左右，甾醇转化率较高。

2.2不同投料量对甾醇转化率的影响

甾醇是一种疏水性化合物，难溶于水，过量底物难以被大豆油溶解分散，且会对细胞产生毒性，不利于转化率的提高，从而对原料造成浪费。在大豆油/水双相发酵系统中，随着甾醇投料量的增加，转化率上升到一定水平后呈下降趋势。当投料浓度达到1.5%时转化率可达到85%左右，继续提高甾醇投量至2%转化率下降至80%以下。

2.3不同比例吐温-80对甾醇转化率的影响

表面活性剂的分子结构与细胞膜相似，在微生物转化过程中，它可以增加底物的溶解度，同时改变细胞膜的通透性。吐温80是一种常见的水包油型表面活性剂，试验证明在大豆油/水双相发酵培养基中添加吐温80可有效提高甾醇转化率，投量为0.2%时，转化率可达到85%左右。低于该浓度，其对甾醇的溶解能力及对细胞膜通透性影响较小，而高于该浓度，则破坏细胞膜通透性，转化率均不能达到理想水平。

2.4正交试验

根据单因素试验结果，选择大豆油投料浓度，底物甾醇投料浓度和吐温80投料浓度3因素，以AD转化率为考察指标，设计L9（3）4正交试验，正交试验设计及极差分析见表2，方差分析见表3。

正交试验分析表明，各因素影响从主到次分别为A（大豆油浓度）、B（甾醇浓度）、C（吐温80浓度）。最优方案为A2B2C3，即大豆油20%，甾醇投量1.5%，吐温80浓度0.2%，此方案最高转化率87.27%。

方差分析结果可以看出，三因素对转化率均有影响，都不显著。但是与其他发酵系统相比，甾醇的转化率有较大提高，优化试验对大规模化生产具有一定指导意义。

三、结论

（1）构建大豆油/水双液相发酵系统，可以有效解决甾醇难以溶解乳化的问题，与传统单水相发酵相比，不仅产率有大幅提高，且更安全、环保。

（2）在大豆油/水双液相发酵系统中，研究了大豆油在发酵液中所占比例、甾醇投料浓度以及添加表面活性剂如吐温80等因素对产物转化率的影响，对AD的工业化生产具有一定的指导意义。

（3）通过正交试验，确定了甾醇生物降解的最佳工艺条件。最佳工艺条件：大豆油20%，投料量1.5%，添加0.2%吐温-80，转化96h，植物甾醇转化率达到87.3%。

参考文献

[1]杨英，姜绍通.微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4-烯-3，17-二酮的研究进展[J].微生物学通报，2006，33（6）：142145.

[2]张裕卿，王东青.植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展[J].微生物学通报，2006，33（2）：142～146.

[3]陈陶生.近代工业微生物学[M].上海：上海科学技术出版社，1982，53

[4]Wang Z.，Zhao F.，et a1.Microbial transformation hydrophobic compound in cloud point system[J].Mol Catal BEnzyma，2004（27）：147～153.