大腹园蛛次壶腹腺丝的表达研究

近期，世界上首次报道了大腹园蛛Araneousventrcosus临时捕获丝蛋白(Minorampullatespidroin，MiSp)全长编码基因序列，该蛋白序列富含Gly和Ala(约为64％)，且主要由GX、GXX、GXXX和poly-A等重复模块组成。为A.ventrcosusMiSp全序列以及其他丝蛋白基因的表达，寻求合适的表达系统，本研究以大肠杆菌BL21(DE3)的表达为参照，在毕赤酵母GS115中首次尝试了MiSp重复编码区的部分序列的表达。该序列长1348bp，我们将它分别导入GS115和BL21(DE3)表达载体pPic3.5和PKT，并在GS115及BL21(DE3)中诱导表达。表达产物经Ni-NTA纯化后由SDS-PAGE和Westernblot检测，结果表明两种系统都可成功表达该段序列，且可溶性好。相比而言，优化后的毕赤酵母GS115系统的表达水平(产量/产率：相对表达量)明显高于大肠杆菌BL21(DE3)，就自身未优化前也有很大提高(约6~7倍)。表达产物相对完整稳定，纯化回收效率也远高于大肠杆菌系统。由此，毕赤酵母表达系统相比大肠杆菌系统更适合蛛丝蛋白重复片段的表达，是一种更好的天然蛛丝蛋白表达宿主。本研究为选择天然蛛丝蛋白基因表达系统提供了线索，也为A.ventrcosusMiSp全序列的表达奠定了前期实验基础。

材料与方法

1.材料

MiSp阳性克隆由早期建立的A.ventrcosusfosmid文库筛选鉴定得到。实验所用酵母表达载体pPic3.5购自Invitrogen公司，大肠杆菌表达载体PKT则由PET32(a+)改造而来。实验所用的宿主菌E.coliBL21(DE3)、DH5α和P.pastorsGS115分别购置Merck公司、上海生物工程技术有限公司和Invitrogen公司。DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Fermentas公司。Phusionmix购自NEB公司。质粒抽提和胶回收试剂盒购自上海生物工程技术有限公司。酵母基因组抽提试剂盒购自天根公司。蛋白纯化Ni-NTA购自Qiagen公司。6xHis-tag,anti-mouse，mAb抗体购自Merck公司。Westernblot试剂盒购自Invitrogen公司。实验中所用培养基配方参见分子克隆第三版。

2.酵母表达载体PIC3.5-P1的构建、转化及阳性克隆GS115:PIC3.5-P1的鉴定

以A.ventrcosusfosmid文库筛选鉴定的MiSp阳性克隆为模板，设计PCR引物(P1和P2，见表1)，并分别在引物上下游引入酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ。PCR扩增目的片段P1经酶切后与pPic3.5载体连接，命名为PIC3.5-P1，该重组质粒分别经酶切和测序鉴定。P1编码序列如图1所示。参照Invitrogen公司的酵母表达手册，将由StuⅠ单切线性化的PIC3.5-P1重组质粒转入GS115感受态细胞，涂布于MD平板，30℃倒置培养3~5d。挑取单克隆扩大培养，采用天根生物科技有限公司酵母基因组提取试剂盒抽提酵母GS115:PIC3.5-P1重组基因组，并以其上特定序列为模板进行PCR检测，引物P3和P4(见表1)。

3.PIC3.5-P1在酵母中的表达优化和鉴定

挑取阳性重组子单克隆至50mLBMGY培养液中，30℃、250r/min振荡培养。每3h取样测培养液吸光度(OD600)，并绘制生长曲线图。将重组GS115接种于50mLBMGY中，同时引入对照(空酵母菌GS115和带有pPic3.5空载体的GS115菌株)，30℃、250r/min摇床培养至OD600达2~6，约18~20h。方案1(常规组)：直接取BMGY培养液，离心收集菌体，适量转接至BMMY培养基，至OD600达0.8~1.0，每24h补加甲醇使其浓度保持0.5％，诱导48h。方案2(优化组)：取1~2mL培养液至新鲜50mLBMGY培养基至OD600达0.1~0.2，250r/min摇床培养至OD600达0.8~1.0，离心收集菌体，将全部菌体转移至50mLBMMY培养基，OD600达0.8~1.0，30℃、250r/min振荡培养，每24h补加甲醇使其浓度保持0.5％，诱导48h。吸取诱导后的菌液至50mL离心管中，3000×g离心5min，弃上清，收集菌体，按10％(W/V)加入裂解液(50mmol/LTris，50mmol/Limidazole，500mmol/LNaCl，pH7.4)重悬细胞。取20μL细胞悬浮液，加入5μL5×loadingbuffer，100℃水浴10min，顺势离心后进行SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。

4.酵母表达产物PIC3.5-P1的纯化

诱导后的菌液转移至50mL离心管中，3000×g离心5min收集菌体，按10％(W/V)加入裂解液(50mmol/LTris，50mmol/Limidazole，500mmol/LNaCl，pH7.4)重悬细胞。采用JnBio的高压破碎仪1500~1800Pa破碎酵母，反复3次，8000×g离心20min分离上清和沉淀。可溶性蛋白和不可溶性蛋白分别采用非变性和变性纯化的方法纯化，方法均参照Qiagen标准手册。

5.大肠杆菌表达系统的构建，表达及纯化

借助于PIC3.5-P1两端的酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ，酶切后经连接反应插入到PKT载体，构建克隆PKT-P1，经菌液PCR、酶切和测序鉴定。选取重组表达质粒转化至BL21(DE3)，挑取单克隆37℃培养10h,按1∶100的比例接种于50mLLB培养基(卡那霉素30μg/mL)，培养至OD600值达0.6~1.0时加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，37℃诱导2.5h，蛋白鉴定同1.3。裂解液重悬离心收集的菌体，超声波破碎细胞，8000×g低温离心20min分离上清和沉淀。纯化方法同1.4。

结果

1.GS115:PIC3.5-P1及对照BL21(DE3):PKT-P1阳性克隆的鉴定

通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切反应，将目标DN段分别插入载体pPic3.5和PKT，构建克隆PIC3.5-P1和PKT-P1。重组质粒由BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，琼脂糖凝胶图谱检测正确。另外，测序结果证实，该片段为MiSp重复区片段，且无核苷酸突变，可用于后续的表达研究。载体PIC3.5-P1通过转化进入酵母GS115后，涂布于his营养缺陷MD培养基，3~5d后，可见生长良好的菌落，经过PCR鉴定证实P1基因通过同源重组转入酵母基因组中。BL21(DE3):PKT-P1转化子经菌液PCR、测序鉴定，结果正确。

2.GS115:PIC3.5-P1表达优化及与参照BL21(DE3):PKT-P1的比较

目标基因长为1348bp，融合表达产物的理论分子量为38.54kDa。诱导菌液SDS-PAGE检测结果如图2所示，P1在GS115出现和对照BL21(DE3)大小一致的带，为34~50kDa，阴性对照相应位置则无条带。以组氨酸标签(6×his)作为检测抗原，以6×His-tag、Anti-Mouse、mAb为一抗，Alk-Phos.conjugatedAnti-Mouse为二抗，参照Invitrogen产品实验技术，采用Westernblotting进一步检测，该条带为目标蛋白。此外图中于50~90kDa间，大约80kDa处的也出现了条带，而这初步推测是由于酵母的超糖基化、磷酸化所致，且本序列经相关生物学软件分析，如图1所示，存在多处糖基化、磷酸化位点，而这种超糖基化或磷酸化现象与优化条件是紧密相关的。

3.PIC3.5/PKT-P1表达产物的纯化

在变性(含有8mol/LUrea)与非变性的条件下通过Ni-NTA对GS115：PIC3.5-P1菌体破碎产物沉淀及上清进行纯化。如图3所示，在e1-3泳道中34~50kDa处可以看到明显的目的条带，而沉淀中无明显的目的蛋白条带(E1-E6)，这表明目标产物，即MiSp部分重复区，能以可溶形式存在破碎液上清中。对于参照大肠杆菌，采用相同的办法对产物进行纯化处理发现，目标蛋白也是以可溶的形式存在。除了目的条带，26~34kDa处还发现一条带，这是部分目标蛋白中P1融合的intein蛋白在纯化过程中断裂后剩余的部分P1，与理论大小26.61kDa相符，研究表明intein融合蛋白表达时容易发生断裂现象[16]。本实验最初融合intein大约12.45kDa，是为后续剪接实验准备，与蛛丝基因表达无关，这里不进一步讨。纯化结果进一步与参照比较发现，纯化后GS115的产率(目的蛋白占总蛋白的比例)明显高于BL21(DE3)，如表3所示，可达到13~14倍。

4.P1表达的优化及产量、产率及纯化效率的分析

对P.pastoris表达系统进行了初步优化，首先统计绘制了重组菌在BMGY培养基中的生长曲线，如图4所示。为同时保证诱导时适度的菌体密度和最佳生长状态，选取18~20h对数生长中后期的BMGY培养物转接于新鲜的BMGY培养基。在新鲜的BMGY培养基中菌体重新分裂至OD600大约0.8左右，离心后按1∶1转接至新鲜BMMY培养基。如此通过再次分裂，保证新生的菌株在图4重组菌株GS115:PIC3.5-P1在BMGY的生长曲线Fig.4growthcurveofrecombinantGS115:PIC3.5-P1inBMGY.状态最佳时诱导；同时，诱导时菌体密度较低，保证了充足的营养物质。参照SDS-PAGE表达图谱，利用ImageJ软件比较分析各组蛋白的表达水平，结果如表2所示，优化后的表达量可提高6~7倍。如表3所示，我们分析比较了纯化前后P.pastoris和E.coli中目的蛋白的产量和产率，并进一步计算了相应的纯化效率。P.pastoris和E.coli中重组蛋白的产量和产率存在较大差别，根据ImageJ分析比较的数据，纯化前，P.pastoris表达系统经初步优化后，表达量可提高为原来的6~7倍，达到E.coli的2~3倍，产率达E.coli的6倍，由此可以看出，两种表达系统对P1的表达水平存在较大的差别。另外经纯化，表达差距进一步扩大，说明P.pastoris和E.coli两种表达系统的纯化效率也存在较大差异，如表3所示，P.pastoris为E.coli的6倍左右。

讨论

自20世纪80年代以来，科学家就开展了蜘蛛丝的多项研究，包括基因克隆、蛋白表达以及仿生丝纤维的应用等，但蛛丝在表达上的困难严重阻碍它的发展。迄今为止，国内外只获得了3种丝纤维蛋白的全长基因组序列，分别为MaSp(Majorampullatespidroin)、MiSp和AcSp(Aciniformspidroin)，其中MaSp和AcSp均来自黑寡妇蜘蛛Latrodectushesperus，而MiSp则来自A.ventrcosus，由本课题组筛选鉴定[15,20-21]。这些完整的蛛丝蛋白，分子量大、编码基因GC含量高，常见的表达系统很难完成其全长的表达。而研究表明，高分子量是决定蛛丝性能的重要因素，对此科学家分别尝试了不同的方法来获取高分子量的重组蛛丝蛋白[11,13]。2010年韩国科学家在代谢水平对大肠杆菌进行改造，补充Gly酰tRNA，最终表达出284kDa的MaSp重组串联蛋白，但表达量较低，获得的重组蛛丝蛋白的纤维性能只有天然蛛丝的一半[13]。2012年德国科学家尝试了用蛋白质内含子(Intein)介导拼接的方法表达出高分子量的蛛丝蛋白，他们利用intein的体外剪接反应，在体外让融合intein的蛛丝蛋白相互剪接产生Flag蛋白的串联体，产物可达到约300kDa，但是该方法特异性较差，随机性较强，产物的大小无法控制，因此难于得到目标产物，不适合大规模的纯化生产[11]。

为了寻找适合表达天然蛛丝蛋白全长基因的系统，本研究在P.pastoris表达系统中首次尝试表达天然的MiSp部分重复序列(P1)，并与大肠杆菌表达结果进行比较。P1编码氨基酸序列富含Gly和Ala且高度重复，符合蛛丝蛋白序列的典型特征，在异源表达时，容易因为宿主密码子使用的偏爱性及稀有氨基酸合成代谢不足而受到影响；另外，片段本身的大小亦会一定程度上决定表达水平和产物的完整性，而有研究报道E.coli在表达高重复的大片段蛛丝蛋白时，容易出现表达提前终止现象，而片段达到1000氨基酸长度，表达效率就会明显降低[2,13,22]。本研究结果表明在P.pastoris和E.coli系统中，P1均实现了表达，蛋白产物可溶性好(图3)，采用非变形纯化即可得到可溶性的蛋白。我们还分析比较了两种表达系统中P1表达量和产率，在优化后P.pastoris表达系统中，P1表达量高，为E.coli表达系统的2倍左右(表2)。这是由于天然的MiSp基因含有数十个精氨酸(Arginine)等，E.coli系统因为密码子的偏爱性无法高效的表达该氨基酸；另外，由于P1编码的氨基酸Gly和Ala含量非常高(60％左右)，E.coli表达系统的氨基酸合成亦会受到影响。P.pastoris为真核表达系统，可以更好地编码上述稀有密码子。参照GS115生长曲线(图4)，对P.pastoris表达系统进行初步优化，选择18~20h对数生长中后期的BMGY培养物转接新鲜BMGY，离心收集菌体去除了陈旧的培养基等，减轻了经过长期的代谢产生的有害物的影响以及pH的变化的影响、提高的菌体的代谢水平，菌体生长状态；二次培养达到较低菌种密度开始诱导，外环境营养丰富，更好地促进了外源基因的表达，优化前后表达量可提高6~7倍。P.pastoris系统是常用的真核表达系统，较E.coli而言，有更大的优化空间(包括诱导时间、诱导甲醇浓度和扩大发酵培养等)，且易于扩大，适合工业大规模生产，是表达蛛丝蛋白或其他多重复大片段分子的良好宿主[23]。由于蛛丝基因本身的特点，为了获取更高表达量的重组蛋白，我们将会进一步优化P.pastoris表达系统并尝试MiSp天然基因和其他蛛丝蛋白基因的全长表达。

本研究通过对P.pastoris和E.coli两种表达系统的比较以及对P.pastoris系统的优化，证明了P.pastoris作为天然蛛丝蛋白MiSp表达宿主的优越性。为天然蛛丝蛋白基因可溶性表达提供了线索，也为A.ventrcosusMiSp全序列的表达提供了前期实验基础。（本文图、表略）

本文作者：杨子江 陈格飞 孟清 单位：上海东华大学生物科学与技术研究所