多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达研究

摘要：真核生物的许多蛋白富含二硫键。由于大肠杆菌细胞质中含有二硫键还原酶，利用大肠杆菌生产具有生物活性的重组二硫键蛋白充满挑战。近年来，SHuffle菌株、超氧化性细胞的相继问世，利用分子伴侣或引入二硫键从头形成体系，使多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达成为可能。简要概述了野生型大肠杆菌细胞周质和经遗传改造的工程茵细胞质中二硫键的形成机制，并着重介绍了近年来重组二硫键蛋白表达策略的最新研究进展，对利用大肠杆菌反应器生产富含二硫键蛋白起指导意义。

关键词：二硫键蛋白：大肠杆菌；Dsb蛋白；分子伴侣；巯基氧化酶；超氧化性细胞

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2015）03-0258-07

蛋白质在细胞的各种生命活动中扮演了重要的角色，如信号传导、免疫应答、细胞粘附等。20世纪70年代，DNA重组技术的应用，使蛋白质能在多种宿主细胞中表达[1]。总体上，高产率重组蛋白的获得比较困难且不可预计，尤其是目标蛋白存在翻译后修饰，如形成二硫键。真核生物内的二硫键蛋白普遍存在，对人类基因组的预测表明，大约30%的蛋白定位于内质网，而其中一半数量含有二硫键[2]。二硫键可在构象上固定多肽链的骨架或改善其热动力学稳定性，以抵抗高温、强酸、强碱等伤害。因此，二硫键蛋白常被分泌到细胞外或锚定于细胞膜，它们适于作为治疗药物（如胰岛素、抗体）或制药产业的靶标蛋白[3]。工业化生产及科学研究也需要大量的活性蛋白。

真核细胞（酵母、昆虫、中国仓鼠卵巢细胞）表达二硫键蛋白，时间长且花费大，而无细胞表达体系难以实现扩大化生产。大肠杆菌是目前首选宿主菌之一，因其具备生长快、操作简单、产量高等特点备受人们青睐[3]。大肠杆菌中二硫键蛋白的形成定位于细胞周质，但蛋白产率低。而大肠杆菌细胞质缺乏真白表达所需的翻译后加工机制，因此多数二硫键蛋白在细胞质中形成包涵体。蛋白包涵体只能通过变性、复性等过程获取一定比例的活性蛋白，且方法繁琐、产率低下、通用性不强。因此如何改善大肠杆菌细胞的表达环境以获得高产率的活性二硫键蛋白，是科学家们致力于解决的难题。本文介绍了大肠杆菌中二硫键的形成机制，并综述近年来二硫键蛋白表达策略的最新研究成果，为富含二硫键蛋白在大肠杆菌反应器的重组表达或工业化生产提供理论基础。

1 大肠杆菌细胞周质二硫键的形成

1.1周质蛋白分泌机制

多数大肠杆菌分泌蛋白首先被合成蛋白前体。它们的信号肽由Sec分子识别，根据信号肽的种类，Sec机制分为翻译后和共翻译转运两种方式。在前者，细胞质内的伴侣分子SecB与前体蛋白结合，并维持蛋白的未折叠状态直至接触移位酶。而共翻译转运方式是在翻译过程中蛋白的信号肽由信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）识别，整个SRP-核糖体一新生多肽复合物再与Sec移位酶结合[4] 。少数分泌蛋白采取一种双精氨酸转运系统（lwin arginine translocation system，Tac），该系统转运蛋白的信号肽带有特征性双精氨酸基序。与Sec机制不同，Tal系统中蛋白以紧密折叠形式经过细胞膜。该系统可能与细菌产生抗生素耐药性有关[4] 。

1.2 DsbA/DsbB氧化系统

转运至细胞周质的多肽由Dsb蛋白（Ds-bA-DsbG）催化形成二硫键。肽链半胱氨酸的硫醇盐阴离子首先亲和攻击DsbA的活性中心，并与DsbA形成分子间二硫键中间体。该中间体很不稳定，由肽链另一个硫醇盐阴离子亲和攻击而快速释放，肽链形成二硫键，DsbA被还原[5]。

还原态DsbA经DsbB的重新氧化实现活性再生，而DsbB则通过电子传递系统再被氧化。DsbB是细胞内膜蛋白，它具有4个跨膜螺旋的核心区相两段暴露于细胞周质的柔性区。DsbB有两对二硫键，其柔性区的二硫键首先从DsbA获得电子，再传递给跨膜区附近的半胱氨酸对[6] 。该对二硫键被还原后，其中一个半胱氨酸可与辅因子醌的芳环形成电荷传递复合体。有氧条件下，电子经细胞色素bo、bd氧化酶传递给氧气分子，而缺氧时，电子的最终受体改变，由甲基萘醌将电子传给延胡索酸或硝酸盐等[7] （图1）。

1.3 DsbC/DsbD异构化系统

DsbA参与二硫键形成反应是快速且非特异的，它倾向于催化顺序排布的半胱氨酸对形成二硫键。因此蛋白存在多对非连续性二硫键时，就容易发生错误配对，其在细胞内积累或被降解[9]。大肠杆菌存在相应的纠错机制一周质中的二硫键异构酶DsbC，可识别并帮助错误折叠蛋白恢复自然状态。

体内的DsbC是两个亚基组成的同源二聚体，整体呈V形。每个亚基具有二聚体化和硫氧还蛋白两个功能域，它们依靠一段短的螺旋区连接。DsbC共有4个半胱氨酸，硫氧还蛋白功能域C端的两个半胱氨酸形成二硫键，稳定DsbC的空间结构[10]。N端的半胱氨酸对是DsbC的活性中心，它们具有CXXC催化模序，并由DsbD维持还原状态。DsbD是细胞内膜蛋白，它包含3个模块：跨膜功能域DsbDp，细胞周质功能域Dsb Dcv和Dsb-Dy。每个功能域有一对活性半胱氨酸。DsbDβ的半胱氨酸对首先从细胞质硫氧还蛋白获取电子，再传递到DsbDγ功能域，然后经DsbDα最终将电子传递给DsbC[11]（图1）。DsbD及其家族蛋白是目前已知的一类将电子从细胞质膜传递到细胞周质的氧化还原酶。

事实上，DsbC并不是DsbD的唯一底物。DsbG为DsbC的同源类似物，它具有CXXC催化模序，由DsbD维持还原态。最新研究发现[12]除了异构酶活性，细胞周质的DsbG还发挥还原酶作用。某些周质蛋白存在单一半胱氨酸，它们暴露于氧自由基环境易生成次磺酸，或被进一步氧化成磺酸而损害蛋白活性。DsbG表面的负电荷区域适于识别已折叠蛋白，并作为周质还原系统的关键因子防止蛋白的单一半胱氨酸遭受氧化损伤。而DsbC内部排列的疏水氨基酸，似乎更利于它与未折叠蛋白作用并纠正错配二硫键。另外，DsbC也可作为DsbG功能的替补[12] 。

2大肠杆菌细胞质二硫键的形成

2.1 野生型菌株细胞质的还原途径

大肠杆菌细胞质的还原环境不利于蛋白的氧化。Derman等[13] 的开创性工作首先阐明了大肠杆菌细胞质中两条主要的还原途径。一条是硫氧还蛋白途径：包括硫氧还蛋白TrxA和TrxC，并由硫氧还蛋白还原酶TrxB维持还原态；另一条是谷氧还蛋白途径：其核心是谷胱苷肽还原酶（Glu-tathione reductase），它能还原GshA和GshB两种酶，这两类酶与细胞质还原型谷胱甘肽（glu-tathione，GSH）的形成有关。在细胞质中，GSH可直接参与二硫键的还原反应，它首先与底物形成中间体复合物，再由一种谷氧还蛋白（Grxl，Grx2，Grx3）使中间体释放，生成还原态底物和氧化态谷氧还蛋白，后者又在GSH作用下重新恢复还原态[14] 。两条电子传递网络的还原电势均来自细胞质NADPH池[目（图2）。

2.2突变菌株细胞质的氧化途径

在研究野生型菌株细胞质还原途径时，Der-man等[13]发现，同时缺失两个核心基因trxB和gor的菌株无法存活，但这种致死性可祓细胞质内过氧化物酶AhpC突变抑制。AhpC*突变体具有二硫键还原酶活性，它能在细胞质中富集还原态Grxl，保证菌株活力[15] 。trxB的缺失使细胞质内氧化型硫氧还蛋白TrxA、TrxB积累，它们可催化形成二硫键。此突变株被称为FA113 （trxB，gor， ah-p C'）[8]，商业名称是Origami。利用Origami使胶原4-脯氨酰羟化酶在细胞质的表达量远高于野生型BL21的细胞周质[16] 。此外，该氧化型细胞质也用于富集功能性脂肪酶B、神经生长素的Ig2功能域及几丁质酶等[17]。

（trxB，gor-）菌株虽然可实现蛋白的氧化折叠，但其细胞质缺乏二硫键异构化途径。Bessette等I1SI研究发现，DsbC在细胞质过量表达可有效提高二硫键蛋白的活性产率。在体外的无细胞体系，它也有同样效果[19]。受此启发，2012年，Lobstein等[3] 基于（trxB-，gor-）菌株，将dsbC基因插入严格控制的细菌rRNA转录启动子rrnB下游，使DsbC在细胞质稳定且过量表达，改造菌株命名为SHuffle，（图3）。他们比较了3种多二硫键蛋白：荧光素酶（Gaussia， luciferase，Gluc）、尿激酶、组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，vtPA）在SHuffle中的表达活性，认为该菌株促进蛋白折叠具有底物特异性。但SHuffle仍成为表达二硫键蛋白的新选择，如Tait等[20]利用SHuffle表达人疱疹病毒膜蛋白U24，其产量可比普通的BL21（DE3）细胞提高4.3倍。

2.3 DsbC在蛋白二硫键折叠中的研究

在细胞质或周质中表达二硫键蛋白是否需要DsbC的辅助，这与二硫键的形成机制有关。在细胞周质，DsbA首先向未折叠多肽引入二硫键，它倾向于催化顺序排布的半胱氨酸对的氧化。比较而言，（trxB-，gor-）突变体细胞质的二硫键形成机制尚不明确。但与周质中未折叠多肽不同，Kramer等[21]报道核糖体可促进新生肽链形成二级结构，合成蛋白在核糖体通道出口处或已存在部分折叠。这利于氧化酶催化肽链形成正确的二硫键，因而降低了细胞质蛋白折叠对DsbC的依赖。这似乎可解释尿激酶在细胞周质表达时的活性完全依赖DsbC，而在细胞质表达对DsbC的依赖性仅为50%[8]。

DsbC在某些情况下对细胞质蛋白表达非常有利。例如，G蛋白偶联受体（G protein-coupled re-ceptors，GPCRs）是最著名的药物靶标分子家族，一直以来备受科学家关注。B类GPCR的细胞外功能域（extracellular domain，ECD）包含3对保守的二硫键，为蛋白的获取及结构解析带来了较大困难。2008年，Pioszak等[22]将人类甲状旁腺素受体的ECD构建到MBP融合体系，并与DsbC在Origami细胞质内共表达。然后利用目标蛋白与DsbC在体外谷胱甘肽缓冲液中孵育，进行蛋白二硫键重排反应。他们最终获得正确折叠的样品，解析出该蛋白结构。随后，利用此体系他们先后成功表达了皮质激素释放因子受体[23]和垂体腺苷酸环化酶受体[24]。

3 多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达策略

随着大肠杆菌细胞中二硫键形成机制的深入揭示，很多理论广泛应用于真核生物二硫键蛋白表达。特别是近年来人们不断探寻新的方法和体系，使大肠杆菌表达多二硫键蛋白的研究取得了较多成果。

3.1分子伴侣辅助二硫键蛋白折叠

一般地，肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链聚集等折叠过程形成其天然构象。二硫键的形成和肽基脯氨酰键异构化是其中的限速步骤。经典的“自组装学说”认为，肽链氨基酸序列包含了蛋白折叠所需的全部信息。随着研究深入，Emsc251的“辅组装学说”提出体内肽链的折叠需要分子伴侣的辅助。分子伴侣可为二硫键形成等限速步骤提供较长的折叠时间，促进蛋白组装成自然状态。

3.1.1 周质分子伴侣辅助二硫键蛋白表达

细胞周质的分子伴侣包括FkpA、Skp、DegP、SurA等。FkpA是一类通用的折叠增强子，兼具分子伴侣与肽基脯酰胺顺反异构酶（peptidyl-propyl cis-trans isomerase，PPIase）活性。它是V型的同源二聚体，每个亚基的N端参与二聚体化或具有分子伴侣活性，C端为PPIase功能域。FkpA以二聚体界面形成的疏水口袋结合底物，并促进柔性C端接近底物脯氨酰键[25]。它的PPIase活性催化某些稳定的反式肽基脯氨酰键，异构成功能蛋白所必需的顺式构型。目前已发现的PPIase分属于3个蛋白家族：亲环素、FK506结合蛋白以及细小菌素蛋白[4]。

SurA与细小菌素蛋白类型的PPIase具有同源性，它最早从细菌抵抗饥饿胁迫中被鉴定。SurA的空间构象赋予其分子伴侣活性。它的外形类似非规则的哑铃状，其核心模块有一个较深的口袋，偏爱识别含Ar-X-Ar基序的底物。Ar指芳香族氨基酸，X指任意氨基酸[26]。其余分子伴侣，如Skp通常捕获由Sec分泌机制转运的未折叠多肽。DegP是HtrA丝氨酸蛋白酶家族的第一位成员，它用于清除细胞周质变性或聚集蛋白，其分子伴侣或蛋白酶活性受温度调控[26] 。

因细胞周质独特的氧化环境，可将某些二硫键蛋白分泌于周质中表达。但是分泌效率的不可控性以及周质Dsb蛋白、分子伴侣含量偏低，带来了活性蛋白产量不高等问题。在过表达的分子伴侣协助下，蛋白折叠效率增加，活性产率可能提高。2011年，Schlapschy等[27]将FkpA、SurA以及DsbA、DsbC共同构建成新型辅助质粒pTUM4，使4种折叠酶在细胞周质中过表达，提高了分泌蛋白的折叠效率。另外，筛选提升目标蛋白分泌效率的菌株类型也是必要的，如JM83、HM125、KS272等。Schlapschy已利用pTUM4辅助了多种二硫键蛋白的表达，包括恶性疟原虫表面蛋白48/45，树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合的非整合素以及各种抗原结合片段等[27]。

3 .1.2 细胞质分子伴侣增加二硫键蛋白可溶性

相比细胞周质，大肠杆菌细胞质中存在更多的分子伴侣，与折叠相关的分子伴侣系统包括三类[2q：触发因子（trigger factor，TF）、DnaK-Dnaj-GrpE和GroEL-GroES，细胞质中，短的新生多肽首先与核糖体结合的TF相互作用，随着肽链延伸，长链多肽由DnaK捕获。DnaK的N端功能域水解ATP供能，协助C端完成多肽的折叠。共伴侣素DnaJ可上调DnaK的ATP酶活性，而增强DnaK与底物的结合力。另一共伴侣素GrpE通过催化ATP/ADP交换反应介导底物释放。除非底物已完成折叠，否则它可能将被传递给下游的GroEL-GroES系统。GroEL与共伴侣素GroES形成“折叠笼”结构[28]，为底物进一步折叠提供良好的环境。

在大肠杆菌细胞质，多数重组蛋白受控于强启动子，它们的表达水平通常较高。但宿主细胞自身的分子伴侣含量或许无法满足新生肽链正确折叠的需求，导致目标蛋白可溶性降低，甚至形成包涵体。共表达分子伴侣可能有效辅助二硫键蛋白折叠，增加蛋白可溶性。例如，Kyratsous等[29]设计DnaK与GroEL的融合载体，在大肠杆菌细胞质中获得了鼠类朊蛋白的可溶产物。另外，共表达DnaKJ可防止镁离子转运蛋白CorA形成包涵体[30]，或提高人类粒系集落刺激因子（human granulo-cyte colony stimulating factor，hG-CSF）在细胞周质的表达量[31] 。

3.2 融合标签辅助二硫键蛋白表达

除了分子伴侣，利用Dsb蛋白与目标蛋白融合表达，也可促进二硫键正确形成。目前，已有包含Dsb蛋白的商业化载体供选择，如pET-39（Ds-bA）、pET-40（DsbC）。另外，一些细胞质融合标签，如MBP（maltose -binding protein）、NusA（N-Utiliza-tion substance）、TRX（thioredoxin）等也被广泛使用。MBP由大肠杆菌K12的malE基因编码，它能增加融合蛋白的溶解性。而且MBP不含半胱氨酸，避免了与目标蛋白半胱氨酸形成错配二硫键的问题。MBP已成功应用于真核细胞蛋白以及人工合成的单链抗体（single-chain antibody fragment，scFv）的可溶表达[32] 。Houry等[33] 揭示NusA是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。所以NusA可能招募分子伴侣帮助蛋白折叠。另一种TRX标签可防止细胞质蛋白聚集沉淀，甚至挽救错折叠的多二硫键肽链，如槲寄生毒素、猪胃蛋白酶原A旧等。TRX维持蛋白稳定性的机制尚不清楚，但它可能依赖伴侣活性辅助scFv的折叠，理由是突变其催化中心的半胱氨酸，它仍能促进活性scFv的表达[17] 。

3.3二硫键从头形成体系促进蛋白表达

自然界中二硫键的形成可以在三类细胞内隔室中完成，真核细胞内质网、线粒体内膜空间以及原核细胞的细胞周质。相对于这些细胞隔室，大多数野生型原核细胞质几乎观察不到二硫键蛋白的存在。Derman等旧通过（trxB， gor， ahpC）的突变，首先实现了大肠杆菌细胞质内生产二硫键蛋白。

在（trxB，gor-）工程菌中，细胞质硫氧还蛋白参与硫醇一二硫键的交换反应，即它依靠还原底物（如核苷酸还原酶）而将二硫键转移到其他蛋白（如碱性磷酸酶）中，硫氧还蛋白本身不能催化二硫键从头形成。所以Origami等生产的蛋白实为某些代谢途径的副产物，蛋白产率普遍偏低[34]。

3.3.1 Ervlp体系在二硫键蛋白表达中的应用

细胞内隔室的情况相反，它们存在二硫键从头形成的催化酶，如巯基氧化酶，包括内质网的Erol、酿酒酵母线粒体内膜空间的Ervlp等。如果向大肠杆菌细胞质引入二硫键从头形成体系，可能会大幅提高活性蛋白的产率。但是，此类巯基氧化酶不是直接作用于底物，它们需要媒介蛋白的辅助，如Erol依赖PDI，Ervlp依赖Mia40等[34]。另据文献报道，黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adeninedinucleotide，FAD）存在时，酿酒酵母的Ervlp可能独立于Mia40，直接利用氧气分子催化巯基形成二硫键[35] 。另外，人们发现没有任何辅因子时，Ervlp能有效地使变性牛胰胰蛋白酶抑制剂（含两对二硫键）重新恢复自然状态[34] 。因此Ervlp可能是一种单独的催化二硫键从头形成的氧化酶。

利用这一特性，2010年Hat.ahet等[34] 将酿酒酵母的Ervlp引入野生型大肠杆菌细胞质，首次获得比（trxB-， gor-）菌株产率更高的活性目标蛋白。他们的结果不仅颠覆了长久以来野生型原核细胞质不能产生二硫键的普遍观点，还使人们认识到蛋白的氧化折叠除与反应环境相关，还与催化酶类有关。随后，Nguyen等[3q报道，利用预表达体系可进一步提高Ervlp对蛋白氧化的促进效应。但同时还需要融合标签防止折叠中间体聚集。他们通过在细胞质预先表达Ervlp与二硫键异构酶，使活性vtPA（含有9对二硫键）的产量比过去仅依靠DsbC共表达时提高800倍以上。另外，该体系也可应用于分子间二硫键蛋白，如人类抵抗素（Resiscin）是一种抑制脂肪细胞摄取糖分的激素，成熟的Resistin含有5对二硫键，并依靠1对分子间二硫键形成同源二聚体。以往的表达体系难以获得可溶的或均质蛋白，利用上述方法显著提高Resistin同型二聚体的产率。由此可见，这类巯基氧化酶似乎可以促进多二硫键蛋白的高效表达。