氧化型钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.026

基金项目： 国家自然科学基金（81372020）; 湖北省卫生厅青年科技人才项目（QJX 2012-11）;武汉市首批中青年医学骨干人才培养项目

作者单位：430060 武汉，武汉大学人民医院急诊科

通信作者：吕菁君 ，Email：

钙/钙调素依赖性蛋白激酶家族（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase， CaMK）包括CaMKⅠ，CaMKⅡ，CaMKⅢ，CaMKⅣ。其中CaMKⅡ在体内广泛分布，在心肌细胞中高表达。钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为Ca2+信号转导的关键因子，调控细胞的多种生物学功能，包括氨基酸和脂质代谢，离子通道/受体及神经递质的合成与释放，维持细胞内钙稳态，调控兴奋收缩耦联作用。

近年来，蛋白质翻译后修饰与心血管疾病的发生发展机制之间的内在联系受到关注。氧化型Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的发现将Ca2+与氧化应激紧密的联系在一起，NADPH氧化酶/CaMKⅡ 信号通路在心肌梗死后心室重构、病态窦房结综合征的发病机制中起关键性致病作用。氧化型钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的激活位点、激活通路以及下游效应产物成为新的关注点。

1 CaMKⅡ 蛋白翻译后修饰

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ， CaMKⅡ）在20年前被确定是由Ca2+ / CaM 依赖激活的，其磷酸化位点是 CaMKⅡ蛋白活性调节区域第287苏氨酸（Thr287）。研究表明，在没有Ca2+ / CaM 参与下，血管紧张素Ⅱ诱导 CaMKⅡ蛋白活性调节区域第281和第282双蛋氨酸结构氧化，形成氧化型CaMKⅡ（oxidized-CaMKⅡ），导致心肌细胞凋亡[1-2]。进一步的研究表明，CaMKⅡ 第281 / 282 双蛋氨酸结构氧化激活（oxidized-CaMKⅡ）与CaMKⅡ第287苏氨酸位点磷酸化激活（phos-CaMKⅡ）是完全独立的两个过程，并不相互依赖（图 1）。

研究表明，CaMKⅡ的激活存在多种形式，不仅有Thr287磷酸化激活、第281和第282双蛋氨酸氧化激活，糖尿病，长期高血糖导致CaMKⅡ蛋白活性调节区域第280丝氨酸（Ser280）糖基化;交感神经兴奋、神经内分泌过度不仅磷酸化激活第287苏氨酸（Thr287），还导致第272半胱氨酸（Cys272）和第290半胱氨酸（Cys290） 硝基化。

2 CaMK Ⅱ在心脏中的激活通路

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心脏中的激活通路主要通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和β-肾上腺素能受体信号通路（图2）。在心肌细胞中RAAS系统通过AT1受体/NADPH氧化酶信号通路氧化激活CaMKⅡ，同时也能导致磷酸化激活CaMKⅡ蛋白 [3-5]。而β1-肾上腺素能受体信号通路主要磷酸化激活CaMKⅡ [6-8]。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是体内活性氧（ROS）的最主要的来源之一。NADPH氧化酶的经典结构由6个不同的亚单位组成，它们分别是位于细胞膜的核心亚基gp91 phox和调节亚基p22phox，二者形成的膜复合体称为黄素细胞色素b558，以及位于胞质中的水溶性调节亚基Rac、p67phox、p47phox、p40 phox等。在NADPH氧化酶激活时，胞质中的调节亚基转位与黄素细胞色素b558结合，含黄素的gp91 phox催化亚基作为电子传递系统，以NADPH为递氢体，催化反应：

NADPH+2O2 NADP++H++2O2-。超氧化物阴离子（O2-）在超氧化物歧化酶的作用下转化成H2O2。O2- 和 H2O2都是损伤细胞最强的自由基。

血管紧张素激动血管紧张素1受体（AT1受体）诱导NADPH氧化酶活化，细胞内大量的H2O2直接作用于CaMKⅡ蛋白活性调节区域第281/282双蛋氨酸结构，氧化激活CaMKⅡ。激动AT1受体同时也能导致CaMKⅡ蛋白活性调节区域第287苏氨酸磷酸化激活。Mark E Anderson 团队进一步研究证明，异丙肾上腺素通过β1-肾上腺素能受体信号通路，导致CaMKⅡ蛋白活性调节区域第287苏氨酸磷酸化激活，并不作用于第281/282 蛋氨酸[3-5]。

蛋氨酸亚砜还原酶A（methionine sulfoxide reductase A， MsrA）是目前发现的可在体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的主要抗氧化酶系统。研究表明，与超氧化物歧化酶（SOD）相比，MsrA不仅可以在细胞内发挥清除氧化因子的作用，还可以对已经发生的蛋白质氧化进行可逆性修复。在心肌细胞内，oxidized-CaMKⅡ第281 / 282 双蛋氨酸结构氧化修复是通过MsrA介导的。在MsrA作用下，心肌细胞内oxidized-CaMKⅡ氧化还原（图2）。过表达MsrA基因可以显著减轻氧化应激引发的心肌细胞损伤和凋亡[9]。

3 phos-CaMKⅡ和oxidized-CaMKⅡ在心血管病理生理中的作用

phos-CaMKⅡ和oxidized-CaMKⅡ在心血管病理生理中各自发挥着重要作用，包括：窦房结细胞凋亡、心室肌细胞凋亡、早期后除极、延迟后除极，参与慢性房颤，病态窦房结，心肌梗死后心室重构，心力衰竭，恶性室性心律失常的发生与发展。

3.1 oxidized-CaMKⅡ与病态窦房结综合征

2005年，陈劲进等[10]研究发现慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌细胞内游离Ca2+浓度显著高于窦性心律患者，心房肌CaMKⅡ表达显著高于窦性心律组，提示慢性房颤患者心房肌细胞内存在钙超载，Ca2+/CaMKⅡ信号转导途径可能是维持慢性房颤的重要病理生理基础之一。

2011年，Mark E Anderson 领导的团队在J Clin Invest.发表的研究[11]以及Heijmen等[12]的研究表明，NADPH氧化酶关键亚基（P47phox）基因敲除小鼠能够减少血管紧张素Ⅱ诱导的窦房结细胞凋亡、纤维化和功能障碍，提示NADPH氧化酶介导的CaMKⅡ氧化在病态窦房结综合征发病机制中起着至关重要的作用。在细胞实验中，他们应用特异性的CaMKⅡ抑制剂KN-93，能够显著拮抗血管紧张素Ⅱ对窦房结细胞的毒性作用。计算机模型实验显示，血管紧张素Ⅱ诱导窦房结细胞死亡，在窦房结中形成电冲动缺陷，并逐渐扩散，产生窦房结自律细胞与周围心房细胞不匹配，导致窦房结功能障碍。更重要的是，他们比较了心力衰竭、病态窦房结综合征、心力衰竭合并病态窦房结综合征三类患者右心房中oxidized-CaMKⅡ的浓度，研究结果是心力衰竭合并病态窦房结综合征的患者右心房中oxidized-CaMKⅡ的浓度显著高于心力衰竭患者，但是与病态窦房结综合征患者比较差异无统计学意义。这提示氧化型钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ是病态窦房结综合征患者的生物学标志物。

3.2 oxidized-CaMKⅡ与慢性心力衰竭

病理条件下，长时间激动β-肾上腺素能受体可以诱导心肌细胞肥大、凋亡、坏死，从而参与慢性心力衰竭的病理生理过程[13-14]。β1-肾上腺素受体诱导细胞肥大凋亡并不依赖于经典的cAMP/ PKA途径，而是激活Ca2+/CaMKⅡ信号途径[15]。过度刺激成人心肌细胞β1-肾上腺素受体，可通过CaMKⅡ诱导细胞凋亡。CaMKⅡ主要通过核转录因子κB诱导凋亡。在静息状态下核转录因子κB被抑制性κB结合蛋白限制在胞浆内，CaMKⅡ磷酸化后，诱导抑制性κB结合蛋白磷酸化，从而暴露出核转录因子κB的核定位序列使得核转录因子κB转移至胞核内，影响转录，诱导细胞凋亡[16]。CaMKⅡβC转基因小鼠表现为心肌肥大并伴有显著的室壁变薄以及细胞凋亡[17]。

2011年，Mark E Anderson 领导的团队在 Nature Medicine 杂志上发表相关研究表明[18]，醛固酮诱导NADPH氧化酶氧化激活CaMKⅡ，oxidized-CaMKⅡ促进基质金属蛋白酶9在心肌细胞中过度表达，加剧心脏破裂，导致心肌梗死后小鼠病死率增加。CaMKⅡ的心肌抑制剂，蛋氨酸亚砜还原酶A或NADPH氧化酶基因缺陷可以防止醛固酮相关的心肌梗死后心脏破裂。

Joiner等[19]和Luo等[20]进一步研究证实心肌细胞死亡与线粒体内Ca2+超载，线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore， mPTP） 开放及线粒体内膜电位损耗（ΔΨm）有关。心肌缺血-再灌注，心肌梗死，神经源性的损伤，激活CaMKⅡ，增加线粒体钙单向转换电流（I MCU），mPTP过度开放，诱导心肌死亡。心肌缺血-再灌注损伤时，应用线粒体靶向性CaMKⅡ抑制蛋白或mPTP拮抗剂环孢菌素A，等效地防止mPTP过度开放，线粒体内膜电位下降，减少线粒体破坏和细胞程序性死亡。小鼠心肌和线粒体靶向性CaMKⅡ抑制剂减少I MCU，增加心肌缺血-再灌注损伤的耐受性，这表明CaMKⅡ介导的心肌病理性损伤与增加线粒体I MCU密切相关。线粒体靶向性CaMKⅡ抑制剂可以减少心肌死亡和心力衰竭。

3.3 oxidized-CaMKⅡ与恶性室性心律失常

早期后除极（early after-depolarizations， EADs）和延迟后除极（delay after-depolarizations， DADs）是引起恶性室性心律失常和心脏性猝死的核心机制之一。过去20年，大多数实验室的研究一致表明Ca2+浓度增加，α、β-肾上腺素能受体激动，心率增快都能促使CaMKⅡδ全酶中相邻亚基彼此磷酸化，激活CaMKⅡδ。通过自体磷酸化作用，CaMKⅡ可以感知细胞内Ca2+水平，调节细胞内Ca2+摄取与释放，钙瞬变的时程幅度和心肌兴奋收缩耦联。CaMKⅡ 和Ica，L通道的IQ 区结合，使其磷酸化，致离子通道开放延长，增强Ica，L的峰值和时程。活化的CaMKⅡδ通过磷酸化PLB，解除对钙泵SERCA2a的抑制作用，加强肌浆网对Ca2+的摄取能力，增加肌浆网钙容量。CaMKⅡδ过度激活引起Ryanodine 受体功能异常，在细胞静息状态下，Ca2+通过Ryanodine 受体从肌浆网漏至胞浆内，舒张期肌浆网的钙释放激活瞬时内向电流（Iti）引发延迟后除极。

近年来研究结果证实在器质性心脏病中，持续的氧化应激压力通过NADPH氧化酶依赖性ROS氧化激活CaMK，影响INa失活，扩大ICa，L，触发EADs 和DADs，导致器质性心脏病患者发生致命性心律失常[21-25]。

美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Xie等[26]采用膜片钳和钙内流成像负荷技术，研究氧化应激对家兔心室肌细胞动作电位的影响：①由于H2O2氧化激活CaMK Ⅱ，细胞内钙浓度显著增加，触发肌浆网在舒张期不恰当地钙释放，激活瞬时内向电流（Iti）引发延迟后除极。②H2O2 （0.2～1.0 mmol/L）作用心室肌细胞5～15 min，影响INa失活，延长动作电位时程。INa通道阻滞剂河豚毒素（10 μmol/ L）可以拮抗这一作用。③ H2O2增强ICa，L的峰值和延长动作电位平台期，增加钙内流，ICa，L阻滞剂硝苯地平可以拮抗这一作用。影响INa失活，扩大ICa，L，延长动作电位时程导致早期后除极现象的发生（图3）。

CaMKⅡ抑制剂KN-93（1 μmol/ L）可以完全拮抗H2O2诱导EADs，无活性的KN-93异构体KN-92无上述作用。选择性CaMKⅡ磷酸化抑制剂AIP （autocamtide-2-related inhibitory peptide）2 μmol/ L也能显著抑制H2O2诱导EADs发作。与CaMKⅡ抑制剂KN-93比较，CaMKⅡ磷酸化抑制剂AIP的抑制作用更多地表现在影响INa失活，CaMKⅡ抑制剂KN-93对INa失活和扩大ICa，L都发挥作用。

Song Y-H 研究证实CaMKⅡ在短暂的氧化压力下诱导大鼠心肌细胞L-型钙电流（ICa，L） 长时程易化（long-term facilitation ， LTF） [21]。1 mmol/L H2O2作用大鼠心肌细胞5 min，L-型钙电流长时程易化持续约1 h。CaMKⅡ抑制剂KN- 93能够完全逆转H2O2诱导的L-型钙电流长时程易化。进一步发现，氧化激活CaMKⅡ和磷酸化激活CaMKⅡ都参与维持CaMKⅡ的活化。但是肌浆网Ca2+释放和线粒体

ROS生成在持续CaMKⅡ活化中起关键作用。长时程的心肌动作电位重构是通过氧化CaMKⅡ介导的。线粒体氧化激活CaMKⅡ导致与心律失常相关的病理性心肌细胞记忆。

3.4 oxidized-CaMKⅡ参与心肌缺血-再灌注损伤以及心肌梗死后的炎症反应

CaMKⅡ在心肌中的促炎作用是一个新发现。CaMKⅡ参与心肌缺血-再灌注损伤以及心肌梗死后的炎症反应。Ling等[27]首次研究证实在心肌细胞内CaMKⅡδ直接介导NF-κB激活，CaMKⅡδ触发并维持缺血-再灌注损伤导致的炎症基因表达。CaMKⅡδ基因缺失，减弱缺血-再灌注诱导的炎症反应。基因敲除心脏特异性CaMKⅡδ可以保护心脏，减少缺血-再灌注损伤，减少心肌细胞凋亡，减少梗死面积，改善心脏功能恢复。进一步的研究表明，缺血-再灌注迅速增加CaMKⅡ的活性，在再灌注数分钟内活化NF-κB。活化的CaMKⅡ在心肌细胞中的表达直接导致IκB激酶磷酸化，伴随核P65的增加 。

在心肌梗死中，Toll样受体-4促进核因子κB依赖的炎症反应和氧化损伤。MyD88（myeloid differentiation protein 88）是Toll样受体的重要下游信号和功能蛋白。2012年，Singh等[28] 研究发现脂多糖（LPS）激活Toll样受体-4（TLR-4）诱导心肌细胞CaMKⅡ氧化激活，补体因子B是oxidized-CaMKⅡ激活后的下游效应蛋白。野生型小鼠心肌梗死后心脏中oxidized-CaMKⅡ显著增加，但是MyD88基因敲除（MyD88-/-）小鼠心肌梗死后心脏由于缺乏MyD88依赖的Toll样受体信号激活，不表达oxidized-CaMKⅡ。野生型小鼠心肌梗死后心脏中促炎因子TNF-α、补体因子B、心肌细胞死亡和纤维化均显著增加。与野生型小鼠比较，MyD88-/-小鼠心肌梗死后心肌细胞肥大、凋亡、炎症、oxidized-CaMKⅡ的表达、梗死后病死率均显著减少。原因是MyD88-/- 小鼠核因子κB激活存在缺陷[29] 。这些证据表明，Toll样受体/MyD88这条经典的炎症信号通路氧化激活CaMKⅡ，oxidized-CaMKⅡ活化NF-κB参与了梗死后的炎症反应。

综上所述，作为一个新发现的CaMKⅡ蛋白质翻译后修饰产物，oxidized- CaMKⅡ参与了诸多心血管疾病的发生发展机制。oxidized-CaMKⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统和肾上腺素能信号系统的重要效益产物，反映器质性心脏病的氧化应激压力。在心肌细胞中，RAAS系统既氧化激活CaMKⅡ，又磷酸化激活CaMKⅡ。β-肾上腺素能受体信号通路主要磷酸化激活CaMKⅡ。oxidized- CaMKⅡ参与了与心律失常相关的病理性心肌细胞记忆，是病态窦房结综合征患者的生物学标志物。oxidized-CaMKⅡ参与心肌缺血-再灌注损伤，心肌梗死后的炎症反应，以及心肌梗死后醛固酮系统诱导的心室重构。持续的氧化应激压力通过NADPH氧化酶依赖性ROS氧化激活CaMKⅡ，影响INa失活，扩大ICa，L，触发EADs 和DADs，导致器质性心脏病患者发生致命性心律失常。

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（收稿日期：2014-10-08）

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