甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC―1基因表达的影响

摘要：肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer-l，DLC-1）在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调，这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases.DNMTs）参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-I在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR（methylation-specifiC PCR， MSPCR）结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化，而干扰DNMTs后5-8F细胞中dlc-l启动子区甲基化状态被逆转，其异性干扰DNMT1后效果略为显著，提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用，而DNMT1的调控作用更为突出。

关键词：DNA甲基转移酶（DNMTs）；肝癌缺失基因-1（DLC-1）；甲基化；RNA干扰

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0292-07

DNA甲基化（DNA methylation）是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基添加在DNA分子中CpG二核苷酸的胞嘧啶碱基上。在哺乳动物中，甲基化转移酶主要有4个成员，即DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。DNMT1主要在DNA复制和修复中维持其甲基化，而DNMT3则是从头合成甲基化酶，使得原来没有甲基化的DNA甲基化，包含了DNMT3A、DNMT3B和一个调节蛋白DNMT3L，对于富含CpG片段的DNA，DNMT3A甲基化效率不高，但是它显示出比其他甲基化酶更高的准确性，有文献证明DNMT3A与单拷贝基因的甲基化有关。相反，DNMT3B却能快速甲基化富含CpG的片段，而DNMT3L因缺乏起催化作用的亚基，因而其本身并不具备甲基化酶活性，但能作为调节蛋白，协助DNMT3A和DNMT3B，共同进行甲基化作用。

肝癌缺失基因一l（deleted in liver cancer-l，DLC-1）是由Yuan等于1998年通过代表性差异分析（representational difference， analysis， RDA）方法首次从肝脏组织中克隆获得，是GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）家族中的一员，通过激活Rho家族蛋白自身GTP酶活性而发挥作用。DLC-1基因在正常组织中广泛表达，但在肝癌、胃癌、大肠癌、小细胞性肺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调，而且这种异常表达主要与等位基因杂合性丢失和启动子区异常甲基化有关，而基因突变对于DLC-l的影响很小。在肝癌、乳腺癌、非小细胞性肺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤等肿瘤细胞中恢复表达DLC-1，发现该基因不仅能抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡，而且还参与抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。

为进一步研究DNA异常甲基化在DLC-1表达失活中的作用，考察DNMTs对DLC-1启动子区异常甲基化的影响，我们在本研究中将采用RNAi技术，特异性地干扰鼻咽癌5-8F细胞内DNMT1、DNMT34和DNMT3B后，分析DLC-1的启动子甲基化状态和表达情况。

1材料及方法

1.1材料

1.1.1细胞系

HNE1、HNE2、HNE3、CNE2为鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞系；CNE1为鼻咽高分化鳞状细胞癌细胞系；5-8F、6-10B为鼻咽低分化鳞状细胞癌细胞系SUNE-1亚株，5-8F细胞系具有高成瘤、高转移能力；6-10B细胞系则具有成瘤，不转移特性；NP69为SV40T永生化鼻咽上皮细胞系；以上细胞系均为我所保存，于RPMI1640+1O%新生小牛血（newborn calf serum， NCS）的培养基中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，呈上皮样、贴壁生长。

1.1.2主要仪器

VDS紫外凝胶摄像仪购白美国Pharmacia公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Bio一Rad公司；光学显微镜和倒置显微镜购自日本Nikon公司；高速冷冻离心机及常温离心机购自上海赛特离心机公司；-80℃冰箱、二氧化碳生化培养箱购自美国Forma Scientific公司；超净工作台购自江苏苏净集团安泰公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一仪器厂。

1.1.3主要试剂/试剂盒

RPMI 1640、新生小牛血清、TRIzol试剂、琼脂糖购自美国Invitrogen公司；DNase I酶购自瑞士Roche公司；逆转录试剂盒（A3500）、DNA抽提试剂盒（Wizard Genomic， DNA purification kit）购自美国Promega公司；Ex Taq（R）Hot Start Version酶购自大连宝生物公司；偏重亚硫酸钠（SodiumMetabisulfite，S-1516，MW：190.13）、对苯二酚（hydroquinone，H-7148，MW：110.11），蛋白酶K购自美国Sigma公司；质粒小提试剂盒（QIAGENPlasmid mini Purification Kit）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（Qiaquick Gel Extraction Kit，）购自德国QIA-GEN公司。

1.1.4引物

本文中所用RT-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）引物序列南软件设计，MSP（methy-lation-specific PCR，MSP）引物序列参照文献，两种引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。siRNA序列由广州锐博生物科技有限公司合成，所用引物序列见表1。

1.2方法

1.2.1RNA的制备

取细胞1瓶，约1xl06个细胞，PBS液（pH7.2，0.01mol/L）洗涤2次，加入TRlzol l mL，反复吹打均匀；置冰上5min，加入氯仿0.2mL剧烈振摇15s，置冰上2min，11000r/min，4℃离心15min，吸取上层水相至另一新的DEPC处理的离心管中，加异丙醇0.5mL，置-20℃ 20min，11000r/min4℃离心15min，75%乙醇洗涤后用适量DEPC水溶解，-70℃保存备用。

1.2.2细胞基因组DNA的提取

取细胞1瓶，约lxl06个，用D-Hanks液洗涤2～3次，0.25%胰酶消化，1000r/min离心5min收集细胞，PBS液（pH7.2，0.01mol/L）洗涤一次，1000r/min离心5min收集细胞，加入裂解液600μL（10mmol/L Tris-HCl pH8.0， 10mmol/L EDTA pH8.0，15mmol/L NaCl，0.4% SDS，100μg/mL蛋白酶K）；37℃过夜，等体积酚：氯仿（1：1）抽提2次，取上层于另一新1.5mL离心管中，加入2倍体积无水乙醇沉淀.70%乙醇洗涤2次，晾干，TE（pH8.0.含RNase酶20mg/mL）溶解，-20℃保存备用。

1.2.3RT-PCR

总RNA按照Promega公司逆转录试剂盒进行逆转录反应，反应体系组成为：10xReactionBuffer 2μL； MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）2μL； RNasin （40μmol/μL） 0.5μL；AMV逆转录酶（20μmol/μL）1μL； Oligo （dT）lμL；RNA1～5μL（根据每个样本RNA浓度不同，取1～5μL不等）；加入适量灭菌双蒸水至总体积为20μL；反应条件：42℃ 1h，99℃ 5min，置-20℃保存。其次，分别取1μL cDNA产物进行PCR扩增反应，反应体系组成为：lOXreaction buffer 2μL；MgCl2 （20mmol/L） 1.6μL； dNTPs （10mmol/L）0.4μL；primer （10μmol/L） 0.5μL； cDNA lμL；Taq酶（10U/μL） 0.2μL；反应条件为：95℃ 5min， 94℃ 35s，52～58℃ 35s，72℃ 35s，30～35个循环，72℃ 10min。

1.2.4siRNA转染鼻咽癌细胞

将生长在RPMI 1640（10%小牛血清）中的鼻咽癌细胞系5-8F，以（l～2）xl05的密度接种于六孔板中，24h后细胞汇合度达30%～50%。准备转染混合液：A液（100μL）：3μL LipofectamineRNAiMAX （RNAiMAX）+97μL Opti-MEM；B液：5μL siRNA（终浓度为100nmol/L）+95μL Opti-MEM。混合A液和B液，室温静置20min，加入800μL无血清培养基，混合后将液体均匀滴加在细胞表面，5% CO2培养箱中37℃培养6～8h，吸去培养基，换上新鲜的完全培养基继续培养。72h后收集细胞，抽提RNA检测干扰效果以及进一步分析DLC-1的表达和启动子甲基化状态。

1.2.5亚硫酸盐处理DNA

紫外光分光光度仪测定细胞样本DNA的浓度和纯度；将5μg基因组DNA溶于30μL TE；加入3.3μL临时配制的3mol/L NaOH，室温处理15min；将1.82g偏重亚硫酸钠或者亚硫酸钠（NaHSO3）溶于2.8mL双蒸水中，加入430μL 3mol/LNaOH，加入210μL 10mmol/L对苯二酚，调pH值至5.0；在DNA中加入上述溶液333μL；加入矿物油3滴，于55℃水浴避光处理4h；将混合液用DNA纯化试剂盒（Promega）纯化后，溶于50μL灭菌双蒸水中；加入5.56μL 3mol/L NaOH，37℃还原处理15min；加入33μL的10mol/L NH4Ac和3倍体积的无水乙醇，-20℃过夜使DNA沉淀：13000r/min，4℃，离心30min； 70%乙醇洗涤沉淀，13000r/min，4℃，离心10min；风干沉淀，加入20μL TE溶解沉淀，-20℃保存备用。

1.2.6MSP

反应体系如下：lOXreaction buffer （Mg2+）2μL；dNTPs（2.5mmol/L）2μL；primers（甲基化特异性或非甲基化特异性上/下游引物）（10μmol/L） 0.5μL；Treated-DNA 2μL； Ex Taq HS（5U/μL） 0.1μL；灭菌双蒸水12.4μL；反应条件：95℃ 5min，95℃30s，56℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃延伸5min。

2结果

2.1RT-PCR检测DLC-1在7株鼻咽癌细胞及1株永生化鼻咽上皮细胞NP69中的表达

以永生化鼻咽上皮细胞系NP69和慢性鼻咽炎组织为对照，以看家基因GAPDH为内对照，经差异RT-PCR分析，发现在7株鼻咽癌细胞系中均未检测到DLC-l的相应条带（图1A），而在永生化鼻咽上皮细胞系NP69和4例慢性鼻咽炎组织中均可以检测到明显的DLC-1产物（图1A、B）。

2.2 MSPCR分析DLC-1基因启动子在鼻咽癌细胞系中的甲基化情况

将制备好的基因组DNA经偏重亚硫酸氢钠修饰后，作为PCR扩增模板，利用甲基化特异性引物扩增目的片段，分析甲基化情况。本实验检测了NP69细胞系、3例CN组织和7例鼻咽癌细胞系中基因DLC-1启动子区甲基化的情况，发现在NP69细胞系和3例CN组织中，只检测到了非甲基化产物，而在7例鼻咽癌细胞系中只检测到了甲基化产物，结果提示，DLC-1启动子在永生化鼻咽细胞系和3例CN组织中未发生甲基化，而在7株鼻咽癌细胞中发生了完全甲基化（图2A）； MSPCR产物经回收纯化后进行TA克隆并进行测序分析，扩增的甲基化产物在CpG岛处的C受到保护，经亚硫酸盐处理后，仍保留为C；而非甲基化产物在CpG岛处的C全部变成T（图2B）。测序结果进一步验证了MSPCR的结果。

2.3RT-PCR检测甲基转移酶DNMTs在鼻咽癌细胞系中的表达

RT-PCR方法检测了DNMTl、DNMT3A和DNMT3B在7株鼻咽癌细胞系中的表达。结果显示，3种DNMTs在7株鼻咽癌细胞系中均有不同程度的表达，而DNMT1和DNMT3B的表达高于DNMT3A（见图3～5），其中DNMT1几乎在7株细胞中的表达水平均高于DNMT3A和DNMT3B，而DNMT3B在7株细胞中的表达量均不高，甚至有些表达极其微弱。

2.4特异性干扰DNMTs对DLC-1表达的影响

根据文献，我们筛选并合成能特异性干扰DNMTs表达的siRNA。 采用LipofettamineRNAiMAX作为转染试剂，将3对siRNA分别转入5―8F细胞，72h后收集细胞，抽提RNA和DNA，RT-PCR检测每种siRNA的干扰效率、DLC-1基因表达水平以及MSP检测CpG岛的甲基化情况。结果显示，与未处理对照组和非打靶对照组细胞相比，3个DNMTs表达明显下降（图4A），Bandleader软件分析，3个基因表达均被抑制约70%。在特异性抑制3个DNMTs表达后，DLC-1都能重新表达，而以干扰DNMT1后表达较强（图4B）。同时，在扰后的5-8F细胞中检测到非甲基化产物（图4C），这些结果表明，DNMTs对DLC―1启动子区CpG岛有一定的调节作用，在不同程度上影响了DLC-1的表达。

3讨论

鼻烟癌是我国南方省份及东南亚国家或地区高发的一种上皮源性恶性肿瘤，具有明显的种族聚集性和地域性。虽然目前对于鼻咽癌发病、早期诊断和治疗方面已经进行了比较深入的研究，但鼻咽癌发生发展的分子机制仍不甚清楚，而早期诊断和治疗也未取得重大突破。DLC-1作为一个重要的抑瘤基因，自被发现开始，已有大量的研究小组对其失活机制及功能进行了研究，Tripathi等发现，在前列腺癌中DLC-1可以通过Rho蛋白信号通路，上调E-cadherin的表达抑制细胞的转移。Healy等在非小细胞癌中发现DLC-1可以通过依赖RhoGAP功能区域和不依赖RhoGAP功能区域两种途径来抑制细胞生长。Tripathi等 发现DLC-1通过与a-Calenin相互作用稳定粘着连接来增强DLC-1抑瘤活性。本课题小组也通过一系列实验证实了DLC-1在鼻咽癌中表达下调或缺失，它具有抑制鼻咽癌细胞侵袭转移，影响细胞周期和细胞骨架形成等生物学功能。在此，我们也对鼻咽癌中DLC-1失活机制进行了探讨。

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰之一，存在于所有高等动物体内，对于维持正常细胞功能，遗传印记及胚胎发育等过程有着极其重要的作用。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑瘤基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。

在本研究中，我们首先通过RT-PCR检测了3种甲基化转移酶DNMTl、DNMT3A和DNMT3B在7株鼻咽癌细胞中的表达情况，实验表明，DN-MTs在这7株细胞中，均能表达，但是在不同的鼻咽癌细胞中表达量不同。其中DNMT1的mRNA的表达量高于DNMT3A和DNMT3B。而DNMT3A的表达量相较于其他两种，则含量较低。为了进一步证明3种甲基化转移酶在DLC-1甲基化过程中如何发挥作用，我们利用RNAi技术，通过分别特异性干扰5-8F细胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达，在三者的干扰效率均达到70%的情况下，均检测到DLC-1的重新表达，同时其启动子甲基化程度有所缓解。这些结果可以进一步说明，DLC-1启动子区的高甲基化与其在鼻咽癌中的表达下调或缺失有关。同时我们也发现，相对于干扰其他两个DNMTs来说，DNMT1干扰后有比较明显的逆转效果，但总的来说，DLC-1重新表达的强度并不大，说明3种DNMTs联合作用可能对于基因启动子高甲基化的作用更明显。

总之，本文首次通过实验证实了在鼻咽癌中DLC-1的失活主要与DNA启动子甲基化有关，且这种启动子甲基化与DNMTs密切相关。这些为我们进一步深入研究DLC-1在鼻咽癌发生发展中的作用及分子机制奠定了良好的基础。