丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的影响

【摘要】 目的 探讨丹酚酸B对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的疗效。方法 雄性SD大鼠36只随机分组,对照组、模型组及丹酚酸B治疗组各12只,对照组给予普通饲料,其余各组均给予高脂饲料。于12周处死模型组。治疗组每天以浓度为1 mg/ml的丹酚酸B溶液20 ml/kg灌胃,同时继续高脂饲料喂养,对照组以20 ml/kg蒸馏水灌胃,同时继续普通饲料喂养。于实验第24周处死剩余实验动物。测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)及肝组织丙二醛(MDA)含量,同时观察肝组织病理学改变,免疫组化法检测肝组织TIMP1的表达,RTPCR法检测肝组织TGFβ1mRNA的表达。结果 与正常对照组相比,模型组肝指数、血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA水平显著升高(P

【关键词】

丹酚酸B;大鼠;非酒精性脂肪性肝炎

Effects of Salvianolic acid B on nonalcoholic stentohepatitis in rats

WANG Yingchun, LIU Yanfang, ZHU Ruiping Department of Gastroenterology, Sun Yatsen Hospital of Dalian University, DaLian 116001, China

【Abstract】 Objective To study the therapeutic role of Salvianolic acid B(SAB)in treating nonalcoholic stentohepatitis(NASH)in rats Methods Thirtysix male SD rats were randomly divided into 3 groups The normal control group (n=12)wse fed with normal diet.NASH model group (n=12)and therapeutic group(n=12)were fed with fat rich diet, The rats of NASH model group were killed at the 12 th week Therapeutic group was treated with SAB at the dose of 10 mg/kg from the 13 th week and finished at the 24 th week The serum ALT, AST, TG, TC and liver tissue MOD levels were measured, The degrees of hepatic histologic change were observed with HE, Tissue inhibitor of metalloproteinase one(TIMP1) was examined with immunohistochemistry, And the gene mRNA level of transforming growth factor beta one(TGFβ1) was deteced with reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR)Results Compared with the normal control group, the liver index, the serum AIT, AST, TG, TC and liver tissue MOD levels were increased significantly(P

【Key words】

Salvianolic acid B ; Rat; Nonalcoholic stentohepatitis

随着人们生活方式及饮食习惯的改变,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为最常见的慢性肝病,其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可进展为肝硬化及肝功能衰竭,目前缺乏有效的治疗手段[1]。体内外实验证明,丹酚酸B具有清除氧自由基及抗肝纤维化作用[2],对NASH可能有治疗作用。为此,本研究通过高脂饮食复制大鼠NASH模型,探讨丹酚酸B对实验性大鼠NASH的影响。

1 材料与方法

11 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠36只,体重150 g左右,购自大连医科大学实验动物中心。大鼠正常饮食喂养1周后,随机分为3组(n=12),即对照组、NASH模型组及丹酚酸B治疗组。对照组给予普通饲料,其余各组均给予高脂饲料(88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇)喂养。实

作者单位:116001大连大学附属中山医院消化科

验动物自由饮水和进食,分笼饲养于(20±2)℃明暗各12 h动物室内。于12周处死模型组。治疗组每天以浓度为1 mg/ml的丹酚酸B溶液20 ml/kg灌胃,同时继续高脂饲料喂养,对照组以20 ml/kg蒸馏水灌胃,同时继续普通饲料喂养。于实验第24周处死剩余实验动物,隔夜禁食,次日以2%戊巴比妥钠溶液按15 ml/kg腹腔内注射麻醉,下腔静脉采血后处死,迅速取出肝脏,按常规制备血清和肝组织石蜡切片,在肝右叶固定部位切取肝组织液氮保存待测。称体重、肝脏湿重,并计算肝指数(肝湿重/体重×100%)。

12 主要试剂及药品 链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫染色超敏试剂盒、鼠抗TIMP1单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发公司,按试剂盒说明书进行操作。丹酚酸B购自四川本草植物化工有限公司。

13 血清生化指标测定 血清TG、TC、ALT、AST测定,按试剂盒规范操作,全自动生化分析仪检测。

14 肝脏生化指标测定 在相同部位精确称取肝脏10 g,加入预冷的生理盐水,在冰水中制成10%的均浆,4℃3000 r/min离心15 min,提取上清液,用硫代巴比妥酸法测定MDA的含量(试剂盒购自南京建成生物工程研究所),所有操作均按产品说明书进行。

15 组织病理学检测 福尔马林固定肝标本,石蜡切片进行HE染色,在光镜下观察肝脂肪变性和炎症活动情况。肝细胞脂肪变性判断标准:肝小叶未见脂滴肝细胞为阴性,脂滴肝细胞占肝细胞总数小于1/3为(+),1/3～2/3为(++),大于2/3为(+++),几乎均呈脂滴肝细胞为(++++)。炎症活动度计分标准参考Knodell提出的慢性肝炎组织学活动指数(HAI)进行计分,分为汇管区炎症(P),小叶内炎症(L),碎屑坏死(PN)及桥状坏死(BN,包括多小叶坏死)四项,每项依此计分为1、2、3、4分,因为BN、PN的严重程度与预后直接相关,故计分2倍于其他病变,计分公式为P+L+2(PN+BN)。

16 免疫组织化学检测肝组织TIMP1的表达 采用SP法作免疫组织化学染色,切片常规脱蜡、水化、抗原修复、脱水、透明、树胶封片。采用KL型免疫图象处理系统进行半定量指标判断:未见阳性细胞为(),阳性细胞占肝小叶全部肝细胞的1/3以下为(+),1/3～2/3为(++),2/3以上为(+++)。为保证实验结果的可靠性,特别是免疫组织化学的特异性,本实验采用省略一抗和二抗,用PBS代替一抗作阴性对照。

17 RTPCR法检测肝组织TGFβ1mRNA的表达 采用美国GIBCO公司生产的一步法。

总RNA提取试剂盒,TRIZOL试剂按说明书操作提取总RNA,PCR反应体系内含cDNA 2 μl、10хbuffer 5 μl、4хdNTP(2 mmol)2μl、TGFβ1、GAPDH引物各2 μl,Taq酶1U,超重水补至20μl。TGFβ1上游引物5’CTT CAG CTC CAC AGA GAA CTG C 3’,下游引物5’CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C 3’, GAPDH上游引物5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG G 3’,下游引物5’CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG 3’。各取1μg总RNA抽取物加入此反应体系进行PCR循环,循环参数为:97℃ 2 min、94℃ 30sec、56℃30sec、72℃50sec,50次循环。取PCR扩增产物10μl加入2%琼脂糖凝胶中在TAE缓冲液50V 1 h电泳,溴化乙锭显色成像定量分析,结果经计算机图像灰度扫描数字转换后进行统计学处理,以目的基因条带光密度值与内对照GAPDH条带光密度值的比表示目的基因相对表达量。

18 统计学方法 采用SPSS 115统计软件分析,计量资料采用方差分析,等级资料采用秩和检验。

2 结果

21 生化指标的检测:与对照组相比,模型组血清ALT、AST、TG、TC及肝组织MDA等显著增高,治疗组较模型组显著下降。见表1。

表1

各组大鼠生化指标的检测结果(x±s)

组别nALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)MDA(nmol/mg蛋白)

对照组124250±55811243±1672082±032132±027236±024

模型组127248±832a21553±2983a136±044a215±042a482±057a

治疗组123916±825b10226±1841b073±053b116±054b268±087b

注:a模型组与对照组比较,P值均

22 肝脏指数及病理学变化:与对照组相比,模型组肝脏指数明显升高;高脂饮食引起大鼠肝脏明显的脂肪变性,模型组脂肪变性明显,炎症活动度计分显著高于对照组。丹酚酸B治疗组炎症活动度计分显著低于模型组。见表2。

表2

各组大鼠肝脏指数及病理学变化(x±s)

组别n肝脏指数

肝细胞脂肪变性程度

++++++++++

炎症活动度计分

对照组120026±00011200000

模型组120036±0001a000012523±087aa

治疗组120030±0001b03252184±052bb

注:模型组与对照组比较,aP值

23 TIMP1及TGFβ1mRNA的表达:TIMP1检测阳性信号呈现棕黄色颗粒状,分布在肝细胞浆内,未见细胞核着色。与对照组相比,模型组TIMP1表达明显升高;与对照组相比,模型组TGFβ1mRNA的表达显著升高,丹酚酸B治疗组TGFβ1mRNA的表达显著低于模型组。见表3。

表3

各组大鼠肝组织中TIMP1及TGFβ1mRNA的表达(x±s)

组别n

TIMP1

++++++

TGFβ1mRNA

对照组1212000056±009

模型组120642a085±010

治疗组125610b062±005bb

注:模型组与对照组比较,aP值均

3 讨论

NASH是以肝细胞脂肪变性、气球样变、弥漫性肝小叶炎症、肝细胞坏死、肝中央静脉及肝窦周围胶原沉积为特征的慢性肝脏疾病,二次打击理论目前是NASH的主要发病机制,其发生与胰岛素抵抗(IR)密切相关[3]。首次打击由IR和脂肪酸代谢紊乱引起脂肪肝;二次打击在IR的基础上,由氧应激、脂质过氧化、线粒体功能不全、细胞因子等引起肝细胞炎症、凋亡、坏死并促发纤维化进程,导致NASH及NASH相关肝硬化的发生。IR与一次打击造成的肝内脂质蓄积相互作用,形成脂质代谢的恶性循环,机体通过线粒体呼吸链、微粒体细胞色素P450(CYP)、过氧化物酶体等途径产生活性氧自由基(ROS)。当肝内产生的ROS超过抗氧化系统清除能力时便产生氧化应激,而脂肪肝时肝内蓄积的脂肪为氧化应激提供了足够的反应基质。脂肪酸氧化产生肝毒性的ROS,从而加速氧化应激过程,推动了脂肪肝向肝炎及肝纤维化发展的进程。其通过三个主要的机制[4,5]:脂质过氧化、细胞因子的诱导以及Fas配体的诱导作用。ROS激活的血浆或线粒体膜脂质过氧化导致细胞坏死或诱导细胞凋亡。脂质过氧化同样激活丙二醛(MDA)的释放,后者一方面能与肝细胞蛋白结合,形成抗原,激活有害的免疫反应,本研究证实NASH模型组肝组织MDA的含量明显增高;另一方面与线粒体的膜脂、膜蛋白交联,使膜的流动性降低,影响膜中酶的活性,干扰了脂肪酸的β氧化,加重脂肪在肝内蓄积,形成恶性循环。ROS同样增加肝细胞中Fas配体的表达,通过Fas配体与相邻肝细胞上正常表达的Fas受体相作用,诱导细胞凋亡。ROS还激活转录因子NFκB活性,从而增加炎性细胞因子TNFa、TGFβ1、IL6等的产生,TGFβ1为致肝纤维化最重要的细胞因子之一,通过与HSC等细胞膜上的TGFβ受体结合,经细胞内信号传导中介分子smads蛋白的传导,将肝脏炎症损伤等信息传递给细胞核,启动基因转录,从而启动肝脏对炎症损伤等的修复机制,大量合成细胞外基质(ECM)。基质金属蛋白酶(MMPs)可以降解多种细胞外基质成分,其活性受基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)的调节,TIMP1在肝纤维化的形成过程中起着重要的作用,本研究表明TIMP1及TGFβ1mRNA的表达在NASH模型组明显增高。

丹酚酸B为丹参干燥根及根茎中提取的有效成分,是丹参水溶性成分中最重要的活性物质,具有很强的抗氧化作用。本研究表明丹酚酸B治疗组炎症活动度计分、MDA含量及TIMP1和TGFβ1mRNA的表达均显著低于NASH组,提示丹酚酸B具有抑制脂质过氧化反应及抗肝纤维化作用,其机制可能为丹酚酸B能清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应,减少MDA的产生,从而减少肝细胞的损伤,抑制TGFβ1的产生和HSC的增殖活化,具有抗肝纤维化作用。NASH目前缺乏有效的治疗方法[6],因此,丹酚酸B作为治疗NASH有效药物之一,有待于进一步研究。

参 考 文 献

[1] 中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南.中华肝脏病杂志,2010,18(3):163166.

[2] 刘成海,刘平,胡义杨,等.丹酚酸B盐对转化生长因子β1刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用.中华医学杂志,2002,82(18):12671272.

[3] Ramesh S, Sanyal AJ. Evaluation and management of nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol,2005,42(1):212.

[4] Albano E, Mottaran E, Vidali M, et al. Immune response towards lipid peroxidation products as a predictor of progression of nonalcoholic fatty liver disease to advanced fibrosis. Gut,2005,54(7):987993.

[5] Diehl AM, Li ZP, Li HZ, et al. Cytokines and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Cut,2005,54(2):303306.

[6] Torres DM,Harrison SA.Diagnosis and therapy of nonalcoholic steatohepatitis.Gastroenterology,2008,134:16821698.