鞣花鞣质肠道代谢产物urolithins研究进展

[摘要] 鞣花鞣质是一类具有诸多生物活性的酚类化合物，近年来研究发现其发挥作用的物质基础与其肠道菌群代谢产物――尿石素密切相关。该研究就近几年国内外关于尿石素的结构特征、类型、分布，以及其改善前列腺、乳腺、结肠相关疾病，抗癌、抗氧化、抗炎等生物活性研究进行了综述，为开发和利用尿石素奠定基础。

[关键词] 尿石素； 代谢产物； 分布； 生物活性

鞣花鞣质（ellagitannins）是六羟基联苯二酸或与六羟基联苯二酸有生源关系的酚羟酸与多元醇（多数是葡萄糖）形成的酯，水解后可产生鞣花酸（逆没食子酸，ellagic acid）。从生源上看，鞣花鞣质结构中的六羟基联苯二甲酰基（hexahydroxydiphenoyl，HHDP）可认为是由2个没食子酸酰基通过CC键连接而成，是毗邻的2，3或4个没食子酰基之间发生脱氢、偶合、重排、环裂、氧化环和等变化形成的[1]。

近年来，鞣花鞣质作为富含羟基的酚类化合物由于其抗氧化，抗病毒，抗炎，雌激素受体拮抗，保护心脏，抑制NO释放，抗癌及神经保护，抑制脂肪酶及α糖苷酶作用的相继发现，其生物活受到广泛的关注[214]。许多食物来源的鞣花鞣质被发现其在结肠部位由肠道菌群代谢转化生成代谢产物尿石素（urolithins）后才被人体吸收。由于糖基单元未水解及脱羟基作用前鞣花鞣质极性非常大，不利于肠壁对酚类化合物吸收，这种转变在吸收过程中显得极为重要。因此，有报道认为尿石素可能是鞣花鞣质在体内发挥生物活性的物质基础[3，5，7]。目前，国内外对尿石素的代谢过程、组织分布及生物活性的报道逐渐增多。基于此，本文就尿石素的结构特征、类型、分布及生物活性等方面进行概述。

1 尿石素的结构特征、类型及分布

1.1 尿石素的结构特征 尿石素作为鞣花鞣质的代谢产物，是鞣花鞣质对应的鞣花酰基经肠道菌群多级代谢后形成的一类总称。一般，进入体内的鞣花鞣质先水解形成鞣花酸，再失去1个内酯环，逐步脱羟基形成尿石素类物质。尿石素从化学结构上归属于苯并香豆素类，羟基个数因代谢途径不同而命名为尿石素A～D（uroAD）及其甲基化尿石素（methyl urolithins），见图1。此外，尿石素还能与葡萄糖醛酸、硫酸等结合形成糖基化或硫酸化尿石素（urolithin glucuronide or urolithin sulphate）。

urolithin M4， M5， M6， M7为尿石素形成的4个中间代谢产物。

1.2 尿石素的类型及分布 自然界中天然尿石素并不常见，它常以硫酸化、糖基化、甲基化等形式分布于人或其他哺乳动物的血、尿、胆汁、粪便及结肠等组织中，其具体的化合物类型及在体内的分布情况见表1。

2 尿石素生物活性研究

近年来，国外有少数学者对尿石素生物活性进行研究，初步发现尿石素对酶（β葡糖糖醛酸酶，β葡糖苷酶，异构酶等）， 细胞色素P450， Wnt Signaling信号通路，氧化应激， LNCaP细胞的生长和凋亡等都具有一定的作用，并且对某些疾病如炎性肠疾病， 结肠癌， 高血脂症， 乳腺癌， 前列腺癌等都有不同程度的改善。尿石素对神经细胞保护作用亦有少数报道[25]。以下将对其生物活性方面做简要阐述。

2.1 前列腺疾病相关研究 前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见癌症之一。大部分前列腺癌发病机制与雄激素相关且在初期治疗时常为雄激素消融法。但许多癌症病人在后期出现对雄性激素耐药，最后导致病灶恶化，转移，最终导致死亡。因此从天然产物中寻找抗前列腺癌活性的物质显得尤为重要。尿石素由于其结构中具有3个折线型并合的六元环（其中1个为不饱和内酯环），在结构上与甾体化合物具有相似性。而随后的报道也证实了其抗前列腺癌的活性。细胞色素P450酶系中的CYP1B1是公认的前列腺癌化疗靶标，若化合物对CYP1B1活力具有抑制作用，可以说明其对Ⅰ～Ⅲ期（起始，进展，药物耐受）前列腺癌具有改善作用。SASHI等采用一种重组CYP1B1相关的EROD实验方法考察石榴中鞣花鞣质及其代谢产物尿石素对CYP1B1的抑制作用[26]。结果显示uroA在实验中是一种对CYP1B1相关的EROD有效抑制剂，且活性较uroB强。作者随后考察了尿石素在前列腺癌细胞系22Rv1中对TCDD（2，3，7，8tetrachlorodibenzopdioxin）诱导的CYP1抑制活性。结果表明uroA， uroB， uroC及8Omethyl uroA， 8，9dimethyl uroC对CYP1介导的EROD均有抑制作用。同时中性红实验结果提示uroC， 8Omethyl uroA和8，9dimethyl uroC的细胞毒性与其上述活性中IC50密切相关。在细胞摄取实验中作者发现经过代谢后的产物尿石素较其母体化合物吸收增加近5倍。Western blots实验也证明尿石素可能干扰CYP1B1蛋白的表达，从而起到对前列腺癌细胞的抑制作用。

柳叶菜Epelobium hirsutum L.一直被用于治疗前列腺相关疾病，Magdalena等[27]研究了柳叶菜提取物对前列腺癌细胞（LNCaP）的抗增殖作用及对前列腺特异性抗原（PSA）的分泌影响，结果显示提取物作用于LNCaP细胞的半数抑制率IC50仅为35 mg・L-1，细胞分泌的PSA从（325.6±25.3） μg・L-1减少到90 μg・L-1。为了证明提取物中是何种物质在发挥作用，作者对比了提取物中单体及鞣质成分代谢产物uroC对LNCaP细胞的作用，发现uroC能显著抑制细胞的增殖[IC50=（35.2±3.7）μmol・L-1]，同时能显著减少PSA[降至（27.9±3.3）μmol・L-1]和精氨酸的分泌，说明柳叶菜对前列腺癌的作用很可能与鞣花鞣质代谢产物有关。

药物对细胞的抑制作用往往通过干预其细胞周期或促进凋亡来实现，所以研究其对细胞周期和凋亡的影响很重要。Roberto等[28]考察鞣花酸（EA）和uroA对前列腺癌细胞（DU154和PC3）的细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果显示两者均能抑制2种细胞增殖，且EA抑制作用较uroA强；EA诱导细胞周期停滞在与细胞中后期蛋白B1和D1水平有关的S期，而uroA诱导细胞G2/M期停滞，并增加细胞周期蛋白B1和磷酸化cdc2的水平，暗示细胞周期B1和cdc2激酶复合物可能失活。EA可诱导2种细胞凋亡，而uroA只能不太显著的诱导DU145细胞凋亡，对PC3细胞无此作用。说明鞣花酸和uroA 通过控制细胞周期和凋亡协同抑制雌激素非依耐性前列腺癌细胞增殖。随后，CLAUDIA等[29]通过基因组分析，发现uroA可以诱导前列腺癌细胞中P21（一种细胞周期停滞感应器）上调，进一步验证了其抑制前列腺癌细胞作用的机制。

除了上述离体细胞评价外，体内实验亦证实了尿石素的前列腺癌抑制活性。NAVINDRA等对富含鞣花鞣质的石榴汁进行了Ⅱ期临床实验，发现对前列腺特异性抗原（PSA）上升的前列腺癌病人给予石榴汁后病人PSA增加了2倍[30]。在实验中同样发现了体内经鞣花鞣质水解成EA后转化成uroA衍生物的代谢过程。作者同时对接种了人前列腺癌细胞（LAPC4）的免疫缺陷型小鼠（SCID）给予标准化石榴提取物，结果显示尿石素在体内明显抑制了肿瘤细胞的生长。

2.2 雌激素受体激动和拮抗及对乳腺癌细胞的作用

针对尿石素化合物的天然类甾型结构，MAR LARROSA等通过分子模拟软件模拟了尿石素与雌激素受体（ER）的相互作用，预计了尿石素对ER具有激动或者阻滞的作用。为了证实这一假设，作者考察了尿石素对雌激素敏感型细胞系人乳腺癌细胞CF7的细胞增殖作用，并检测了与α/βER的结合能力[31]。研究结果发现uroA， uroB均具有微弱的雌激素样作用且呈现剂量依赖型效应，在高浓度时对细胞增殖没有影响，且未出现明显的毒理学特征。同时还发现2种尿石素具有较高的拮抗雌激素受体的作用，表现在通过竞争性拮抗17βestradiol从而抑制细胞生长，表明了尿石素作为激素干扰型分子，能够发挥其他天然雌激素样物质所具有的作用。随后，LUCA等[32]同样运用计算机模拟软件对28种鞣花鞣质代谢衍生物的体外雌激素活性进行了评价，发现代谢产物的体外雌激素活性因其化学结构的不同而各异，糖基化、硫酸化、甲基化等Ⅱ相产物会影响其对α和β雌激素受体的活性。乳腺癌抑制蛋白（ABCG2/BCPR）是药物运输的载体，它能影响很多分子的药代动力学和毒性。Antonio等[33]以犬肾细胞（MDCK2）为模型，研究uroA， uroB， uroC， uroD及其Ⅱ相代谢物以及前体EA对正常和Bcrp1转化MDCK2细胞主动运输作用的影响，发现uroA及uroAsulphate在Bcrp1转化MDCK2细胞中的易位转运明显增强，其他物质则无明显变化。另外，作者分别用uroA和BCRP选择性抑制剂Ko143作用细胞，给予抗肿瘤药物米托蒽醌，比较两者抗肿瘤药物的转运情况，结果显示uroA可以显著抑制药物的转运，且呈浓度依赖性，提示uroA为ABCG2/BCPR的物质基础，可以调节药物在体内的生物利用度和药代动力学性质。

2.3 对结肠癌细胞及肠道的作用 SASHI等除了研究上述尿石素对前列腺癌细胞抑制作用，针对尿石素代谢场所肠道的癌细胞系HT29细胞也做了相关工作[34]。作者发现尿石素能够显著性抑制HT29细胞系的增殖并具有时间和剂量依赖性，同时阐述了这种抑制作用是通过阻滞细胞周期的G0/G1及G2/M来诱导细胞凋亡。HYUNNHO的研究也证实了这一点，同时还证实uroA， uroB能上调p21的表达[35]。肠道是尿石素的主要代谢场所，尿石素被释放后直接作用于病变部位，抑制细胞增殖并诱导其凋亡，能够减少结肠癌发展进程的风险，具有基础研究及临床应用价值，值得深度开发。

Wnt signaling途径中的某些组成元件在人结肠癌进展中具有中枢性作用。在90%的结肠癌病人癌组织中检测到了某些异常的信号联级放大作用。MEENAKSHI SHARMA等运用经典Wnt信号通路介导的转录激活报告系统TopFlash&FopFlash研究了uroA及EA等对人293T细胞系中Wnt信号途径的影响。研究发现uroA（IC50=9.0 mg・L-1，39 μmol・L-1）能够显著降低Wnt信号途径中核心蛋白βcatenin向核内转移并诱导癌细胞凋亡[36]。

Antonio等以P450酶系为研究对象，考察了uroA， uroB对结肠癌细胞系Caco2中Ⅰ相及Ⅱ相去毒酶调节作用[37]，研究发现以食物来源相当量的尿石素能够诱导细胞中CYP1A1及UGT1A10的表达及活性，且抑制了多种磺基转移酶。小鼠体内结肠部位给药同样证实了尿石素能够诱导CYP1A1的表达。随后，作者通过对比uroA， uroB， uroC， uroD及uroAglucuronide， uroBglucuronide（50，100 μmol・L-1）对Coco2，SW480，HT29 3种结肠癌细胞的抗增殖及凋亡作用，发现尿石素经糖基化后对细胞周期和增殖均无影响，且uroA， uroB与药物传输抑制剂同时使用时，HT29中抑制尿石素糖基化作用变得显著，提示Ⅱ相代谢反应可能会干预尿石素对结肠癌的抗增殖作用[38]。

Mar Larrosa等以右旋糖酐诱导经典的雄性Fisher大鼠炎性肠病模型，以15 mg・kg-1・d-1 uroA灌胃后从肠组织损伤、肠道菌群变化、氧化应激、验证标记物（PGE2， nitric oxide production， iNOS， PTGES）、相关基因表达、LCMS/MS等方面考察了其对该模型抗炎作用[39]。研究发现uroA能减少细胞炎症因子释放及调节病理肠道菌群正常化，并对免疫应答过程中的相关基因COX2等具有下调作用。Antonio等采用体外实验以IL1β刺激结肠成纤维细胞诱导炎症反应，考察了尿石素对炎症的改善作用，研究发现其改善机制可能是通过抑制NFκB和MAPK（mitogenactivated protein kinase）激活，下调了COX2及mPGES1表达，从而减少PGE2的累积。同时未进入细胞的uroA与胞膜上IL1β受体非竞争性结合缓解炎症状态也是其可能的途径之一。

5氟尿嘧啶是临床上治疗结肠癌常用的药物，但是只对少数晚期结肠癌患者有效果，且副反应频发，但与其他抗癌药的联合使用会改善其抗癌效果，所以寻找新的临床抗癌药，增强5氟尿嘧啶的抗癌作用显得非常重要。Antiniao等[40]将uroA和5氟尿嘧啶/5脱氧氟尿苷按一定比例同时作用结肠癌细胞（Coco2，SW480，HT29），发现uroA均可增加癌细胞对5氟尿嘧啶/5脱氧氟尿苷的敏感性，同时阻滞细胞周期循环、促进细胞凋亡，提示uroA可与临床抗结肠癌细胞药物联合用药，增强其抗癌活性，降低其副作用。

2.4 对其他癌细胞的作用 膀胱癌是泌尿系统中最主要的恶性肿瘤之一，目前，临床上多采用化学疗法进行治疗，然而由于存在耐药性，治疗效果并不显著，故从天然药物寻找新的、有效的、毒性小的化合物成为研究热点。QIU等[41]用不同浓度uroA， uroB， methyl uroA和EA作用膀胱癌细胞株T24细胞，考察了代谢产物对细胞的毒性，结果显示均具有抑制其显著增殖的作用，IC50分别为43.9，35.2，46.3，33.7 μmol・L-1。同时，对药物作用后细胞中磷酸化p38MAKP，MEKK1，磷酸化cjun，半胱氨酸酶3及PPARr等的表达水平进行了测定，证明尿石素对细胞的毒性作用与p38MAPK及cjun相关的信号通路有关。从理论上说明，尿石素可以用于膀胱癌细胞化学治疗。

除了膀胱癌外， QIU等还考察了尿石素对肝癌细胞HepG2细胞体外抗增殖作用，发现uroA有较强的抑制肝癌细胞增殖的作用，当uroA诱导细胞凋亡时，肝癌细胞中βcatenin，cMyc和cyiclin D1的表达减少，且TCF/LEF转录激活活性显著下调，同时p53蛋白、p38MAPK蛋白和半胱天冬酶3的表达增加，NFκB p65及其他炎性介质的表达也明显下降，提示uroA可以通过抑制βcatenin信号通路及其同源介质来抑制HepG2细胞增殖[42]。

2.5 抗氧化和助氧化活性 鞣花鞣质由于其分子内羟基个数众多而具有强的抗氧化活性，但是由于其结构中的多元醇及酰基极性较大，因而生物利用度有待提高。细胞内是氧化应激发生的主要场所，抗氧化剂首先必须通过磷脂双分子层进入细胞而发挥抗氧化效应。尿石素由于在肠道代谢过程中脱去羟基或被甲基化，脂溶性水平及细胞相容性较其母体有较大程度的提高。DOBROSLAWA等考察了7种能够进入体内循环的尿石素在粒单核细胞HL60中的抗氧化活性[43]。在细胞内环境中考察尿石素抗氧化活性，对于单纯的体外抗氧化活性而言更能反映尿石素的生物利用度及其生物学意义。研究发现尿石素抗氧化能力与其羟基个数及化合物分子亲油性密切相关。由于uroC和uroD的羟基个数及亲油性适中，二者IC50分别为0.16，0.33 μmol・L-1，而其代谢前体EA及安石榴苷， IC50仅为1.1，1.4 μmol・L-1。同时，Qiu等[4142]用尿石素作用经H2O2诱导损伤的T24细胞和HepG2细胞，发现胞内活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的水平均有所下降，提示尿石素对H2O2诱导的损伤具有抗氧化保护作用。

近些年，人们逐渐意识到植物多酚具有氧化还原作用的双重特性，而尿石素作为多酚类物质鞣花鞣质的代谢产物，除了其抗氧化作用受到关注，有学者对其助氧化作用也进行了研究。Tuija等[44]通过氧化自由基吸收能力（ORAC）、3个基于HepG2细胞实验、铜激发促氧化活性（CIPA）及循环伏安法等实验考察了uroA， uroB的体外抗氧化和促氧化能力。结果显示，ORAC试验中尿石素表现出较强的抗氧化能力；细胞实验中，除了uroA在胞外表现出抗氧化作用，其他均表现出促氧化作用；而CIPA 实验进一步证实了尿石素的促氧化作用；最后，循环伏安法试验表明uroA的助氧化活性部分可逆，uroB则不可逆。可见尿石素根据实验体系和条件的不同即表现出抗氧化活性，有表现出助氧化活性。

2.6 抗炎及改善心血管疾病 炎症是机体对外界刺激的一种防御反应，与许多疾病相关。动脉粥样硬化就是血管壁慢性炎症的结果，炎症反应使得血管狭窄或柱塞，并伴有血管功能。JUAN等[45]以人主动脉内皮细胞为研究对象，经肿瘤坏死因子TNFα诱导后，考察糖基化uroA， uroB和uroA， uroB单体对该细胞的迁移能力、粘附能力及与之相关的细胞因子、蛋白水平的影响，结果发现uroAglucuronide（5～15 μmol・L-1）能显著抑制单核细胞粘附能力（30%，P

除了以细胞为对象的体外抗炎作用研究，Hidekazu等以大鼠为对象，通过角叉革胶诱导炎症反应模型评价了uroA的体内抗炎活性[48]，即分别在右后爪注射造模，前1 h和6 h给老鼠灌胃uroA，观察其右后爪在造模后3，6，24 h的肿胀情况，记录体积，发现与模型组相比，造模前1 h给药老鼠肿胀体积分别减少了35%，26%，34%。而造模前6 h给药的，与对照组相比，体积没有明显减少，说明uroA具有一定抗炎作用。

2.7 其他 晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累对慢性疾病如糖尿病、阿尔兹海默症等的发生有着重要的促进作用，Liu等的研究表明uroA， uroB对糖基化具有一定抑制作用，从而抑制AGEs的形成，可以一定程度上预防和改善慢性疾病[49]。

3 展望

随着HPLCMS/MS等高通量、高灵敏度检测方法的发展和应用，目前，国外对鞣花鞣质代谢产物尿石素（特别是食物来源）的种类、含量变化规律、生物活性等报道日益增多，但国内对尿石素的研究尚处于起步阶段，仅有少量文献报道[5051]，其中，有研究显示，大鼠经灌胃给予石榴皮鞣质后，其尿液中可检测到尿石素，且具有一定活性，为石榴皮鞣质作用机制的阐明提供了新的依据[51]。我国民族药物资源丰富，鞣花鞣质不仅广泛存在于食物中，某些民族药物中也常见鞣花鞣质为主要成分的药物，如石榴皮、老鹳草、地榆、五倍子等。天然存在的鞣花鞣质结构非常复杂，酰基组成差异及空间构象也往往因结构鉴定工作带来不小的困难。由于食物及民族药物经胃肠道给药的普遍性，若能转变其含有鞣花鞣质的研究方法，重点研究其进入体循环之前在肠道形成的代谢产物，将为民族药物发挥作用机制的阐明提供依据。

目前，除了极少数关于尿石素的体内抗氧化[42，48]和潜在的化疗作用[30]的报道外，对于其生物活性研究多为基于酶活性和细胞模型的体外活性评价，相关的整体动物实验或人体试验研究十分有限。鉴于尿石素具有较强的生物活性，有必要结合ADME分析及代谢组学技术对其展开更多的整体动物实验或人体试验，不仅有利于阐明鞣花鞣质的作用机制，也为将尿石素开发成新的针对某些靶点安全有效的药物提供新的思路。

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