姜黄素提取条件的正交设计及硅胶柱色谱纯化的研究

摘要: 目的:优化姜黄药材中总姜黄素的提取和纯化最佳工艺条件。方法:采用正交设计优化乙醇回流法提取中药材姜黄中姜黄素的条件,然后以氯仿-甲醇溶液为洗脱液,采用硅胶柱色谱分离法对姜黄素提取液进一步纯化,以提取物得率、总姜黄素含量和纯度为考察指标。采用HPLC法对姜黄素提取液、纯化后的总姜黄素含量、纯度进行检测。结果:通过正交设计发现温度90℃,乙醇浓度75%,料液比10倍,提取时间3h提取率最高;采用硅胶柱色谱分离法对姜黄素提取液进一步纯化后纯度可以达到81.8%。 结论:该提取条件下提取工艺合理、科学。

Abstract: OBJECTIV: To optimize the extraction and purification process of curcumin. METHODS:The optimum extraction of ethanol refluxing method conditions were investigated by orthogonal design and purification of curcumin solution by silica gel column chromatography method with chloroform-methanol solution, and the content of curcumin was detectd by HPLC. RESULT: The optimum extraction condition obtained was: 75% ethanol, temperature of 90℃ with the volume of 10 folds of curcuma longa, refluxing and extracting for 3 hours. After purification by gel column chromatography method, the purity of curcumin powder was 81.8%. CONCLUSION: The optimized process is feasible for the extraction and purification of curcuma longa.

关键词: 姜黄素;乙醇回流法;提取;纯化;HPLC

Key words: curcuma longa;ethanol refluxing process;extraction;purification;HPLC

中图分类号:R28文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)16-0241-02

0引言

姜黄素(curcumin)是从中药姜黄、郁金、莪术等根茎中提取的一种小分子量多酚类化合物,研究发现姜黄素具有降糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗癌[1-4]等多方面的药理作用。目前姜黄素提取常见的方法有碱水提取法和酶法等[5,6],但这些传统方法操作过程复杂,提取率不高,而新技术成熟的提取条件不易掌握且造价比较昂贵,因而在中药成分提取应用中受到限制,不适合向中小企业推广应用。本研究通过正交设计试验探讨乙醇回流法提取姜黄素的最佳条件,并建立硅胶柱色谱层析技术对姜黄素提取液进行分离、纯化。

1仪器和试剂

姜黄素标准品购自美国Sigma,编号28260,纯度≥95%(TLC),中药姜黄购自哈尔滨市中药材市场天然药业经销部,Waters 2695高效液相色谱仪:美国Waters 公司;甲醇:山东禹王实业有限公司。

2材料与方法

2.1 姜黄粉的制备称取一定量的姜黄中药材,放置在60℃烘箱中干燥5h,然后用粉碎机将其粉碎,过30目筛子即可得到姜黄粉。

2.2 姜黄素提取液的制备分别准确称取经干燥过筛的姜黄粉末20mg,置于500ml烧瓶中,以不同乙醇溶液浓度,温度,料液比,时间为考察因素,进行正交设计实验,然后用高速离心机将提取液进行离心(10000r/min,10min),离心后的上清液移入砂芯漏斗抽滤,然后用乙醇定容到500ml,混匀备用。

2.3 姜黄素提取液的纯化按照正交设计实验获得的最佳工艺条件提取姜黄素,将姜黄素提取液置于旋转蒸发器中浓缩至一定程度备用。

2.3.1 柱色谱展开剂的选择采用薄层色谱分离法选择合适的姜黄素洗脱溶剂,共选择三种展开剂,氯仿-甲醇溶液,氯仿-乙醇溶液,氯仿-乙酸乙酯溶液,通过计算比移值(Rf)以确定分离效果,选择分离效果最好的展开剂作为柱色谱分离所用的洗脱剂。

2.3.2 姜黄素的硅胶柱色谱分离称取 100-200目硅胶100g置于1200C烤箱活化1h,用氯仿:甲醇(75:25)作洗脱剂,装20*1.8cm高的硅胶柱,上样后以氯仿-甲醇为流动相进行洗脱,分步收集洗脱液,每管5mL,共收集13管,对所得到的洗脱液进行液相分析。

2.4 姜黄素HPLC检测方法的建立

2.4.1 色谱条件色谱柱HypersilODSC18柱,流动相:甲醇-1%冰醋酸水溶液(70:30),流速1ml/min,进样量10ul,检测波长424nm,柱温30℃。

2.4.2 标准曲线的制备精确称量姜黄素标准品100μg置于10ml容量瓶中,用甲醇溶解,制成0.5、1、5、10和20μg/ml的姜黄素标准溶液。混匀后进样,测定峰面积,计算回归方程。

2.4.3 HPLC法检测姜黄素条件的验证:通过精密度试验,稳定性试验,回收率实验验证上述色谱条件是否稳定。

2.4.4 样品的检测根据上述色谱条件,分别吸取一定体积的姜黄素标准品溶液和样品待测溶液,以10μl体积进样,测定姜黄素峰面积,按照峰面积计算姜黄素提取液中总姜黄素的含量,姜黄素提取量按照下述公式计算:

姜黄素提取量=X标准品浓度

3结果

3.1 姜黄素检测方法的建立

3.1.1 标准曲线的制备:以峰面积为纵坐标,进姜黄素浓度为横坐标,绘制标准曲线,如图:

求得回归方程及线性系数分别为:y=7.9995x+3866.6,R=0.9999,在0.5-20μg/ml范围内线性良好。

3.1.2 HPLC法检测姜黄素条件的验证:通过精密度试验,稳定性试验,回收率实验证实上述色谱条件稳定,可以用来检测溶液中姜黄素的含量。

3.2 正交设计优化姜黄素的提取条件以姜黄素的浓度为考察指标,对乙醇浓度,料液比,温度,提取时间进行考察,每个因素取三个水平(见表1),应用L9(34)正交设计表(见表2)来安排实验。

3.3 姜黄素提取液硅胶柱色谱纯化将姜黄素提取液在旋转蒸发仪上浓缩后放入硅胶柱内,以氯仿-甲醇溶液洗脱,控制洗脱液流速,每5ml洗脱液收集一管,并采用HPLC检测不同管内洗脱液中姜黄素的含量。姜黄素含量较高的洗脱液主要集中在5～9号管中,因此主要收集第5～9号管的洗脱液。纯化后的液体经低温冷冻干燥后得到一定纯度姜黄素的样品,计算其纯度。

3.3.1 姜黄素含量的测定收集第5～9管的姜黄素洗脱液合并后共约24mL,低温冷冻干燥后取一定量的姜黄素粉末用甲醇溶解到100ml容量瓶中制备成样品溶液进样,按上述的色谱条件进行测定,根据标准曲线计算的24ml姜黄素洗脱液浓度为425.628μg/mL。

3.3.2 姜黄素纯度的计算收集第5～9管的姜黄素,合并后共24mL,测得其浓度为425.628μg/mL,将洗脱液蒸干,测得其重为0.0125g。

姜黄素的纯度=浓度×体积/重量×100%

=4.26×10-4×24/0.0125×100%

=81.8%

4讨论

由于姜黄素不耐高温,见光易分解,不溶于水的特性,本研究采用乙醇低温回流的方法进行提取,以姜黄素提取液中总姜黄素含量作为考察指标,并综合考虑了节省能源和时间。以温度,料液比,乙醇浓度,提取时间为考察因素,通过正交设计实验来探讨最佳提取条件。由统计结果可以看出,在A3B2C3D3 条件下提取效果最好,即温度90℃,乙醇浓度75%,料液比10倍,提取时间3h提取率最高。通过比较各因素与提取率的相关系数,可知影响姜黄素提取的各因素作用大小顺序是乙醇浓度>提取时间>温度>料液比,乙醇浓度和提取时间为主要的影响因素。因此从节约能源和节省时间的角度综合考虑最终确定乙醇浓度75%,提取时间2小时,温度75℃,料液比8倍为最佳提取条件。

在姜黄素的纯化过程,采用色谱柱吸附的原理去除姜黄素提取液中的脂类物质,从而使提取物纯度增高并且容易干燥。本实验采用硅胶极性吸附的原理,以氯仿与甲醇的混合液(75:25)作为洗脱剂,经两次洗脱,效果较好,能得到纯度较高的总姜黄色素。

综上所述,采用本研究所获得的姜黄色素提取条件并对提取液进行硅胶柱色谱分离纯化,实验工艺简单,节省能源和节约时间,提取效率较高,分离完全,总姜黄色素的得率和纯度都较高,应用价值较高,适合推广到企业应用。

参考文献:

[1]Weber W. M, Hunsaker LA, Roybal CN, et al. Curcumin (diferuloylmethane) inhibits consititutive NF-kB activation, induce G1/S arrest, suppresses proliferation, and induces apoptosis in mantle cell lymphoma. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2006,14:2450.

[2]Chen A, Xu J, Johnson AC. Curcumin inhibits human colon cancer cell growth by suppressing gene expression of epidermal growth factor receptor through reducing the activity of the transcription factor Egr-1.Oncogene. 2006,25:278.

[3]Shen SQ, Zhang Y, Xiang JJ, et al. Protective effect of curcumin against liver warm ischemia/ reperfusion injury in rat model is associated with regulation of heat shock protein and antioxidant enzymes [J]. World J Gast roenterol. 2007,13(13):1953-1961.

[4]麦国丰,简燕婷,杨玉捷等.姜黄素对肠炎大鼠肠黏膜基质金属蛋白酶-9的调控[J].第四军医大学学报,2005,26(14):1257-1260.

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[6]陈雁虹,秦波,张媛媛等.姜黄素不同提取方法比较研究.中国中医药信息杂志,2008,7(15):55-56.