电针对脑缺血血管新生的影响

本文作者：潘江 章薇 严洁 常小荣 张泓 陈武善 石文英 潘纯 单位：湖南中医药大学第一附属医院针灸推拿科 湖南省常德第一人民医院

脑梗死是由多种因素导致动脉狭窄或完全闭塞，使脑组织缺血、缺氧、坏死，引起神经功能障碍的一种脑血管疾病。针灸被广泛应用于脑血管疾病的临床治疗。内关穴是针刺治疗中风的常用穴位，是“醒脑开窍”针法的主穴；曲泽穴是心包经的合穴，能理心气、调气血。本课题组前期研究［1］发现电针“内关”及电针“神门”均具有抗脑缺血损伤后心脑组织细胞凋亡与炎性损伤的作用。本实验拟在前期研究与临床应用的基础上，进一步观察电针手厥阴心包经“内关”“曲泽”穴对大脑中动脉梗阻（MCAO）模型大鼠血清与脑组织中血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的影响，探索其抗缺血损伤的作用机制，为针刺心包经穴治疗脑血管疾病提供部分实验依据。

1材料与方法

1．1实验动物SPF级健康成年雄性SD大鼠50只，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（湘）2009－0004，体质量220～250g，3～4月龄。实验前所有动物均在安静环境下饲养，室温22℃，相对湿度55％～70％，其饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按照SPF级实验动物的要求进行制备和消毒，造模前禁食1d。

1．2实验器材及试剂752紫外线可见分光光度计（北京光学仪器厂，220V／50Hz）；酶标仪（美国Bio－Red公司，680型）；HHS－2电子恒温不锈钢水浴锅（上海南阳仪器有限公司）；LEICADMLB2型双目显微镜（德国LEICA公司）；S2－93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司）；MoticB5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）；7001×UVI数字彩色显微图像分析系统（美国Optimas6．5）；DNP－9162型电热恒温培养箱、高速离心机（上海精宏实验设备有限公司）。VEGF酶联免疫（ELISA）试剂盒、VEGFSABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒、一抗、二抗（武汉博士德生物有限公司）。

1．3动物分组将大鼠随机分为5组，每组10只。正常对照组：正常喂养，予以捆绑处理；模型对照组：MCAO造模，予捆绑处理；假手术对照组：分离出血管后不插线，捆绑处理；心包经穴组：MCAO造模后，电针心包经穴“内关”“曲泽”；大肠经穴组：MCAO造模后，电针大肠经穴“合谷”“曲池”。

1．4动物造模采用大鼠大脑中动脉持久性局灶性缺血模型。参照ZeaLonga和Koizumi［2－3］报道的方法，即用颈外动脉插入线栓法建立MCAO脑缺血模型。造模完成后对各组大鼠采用ZeaLonga5级4分制评分：无神经功能缺损计0分；梗死对侧前爪内收、伸直障碍计1分；向偏瘫侧转圈者计2分；行走时向偏瘫侧倾倒计3分；意识丧失、不能行走计4分。选取评分为1～3分的大鼠纳入观察。

1．5穴位定位与针刺方法穴位定位：根据《实验针灸学》［4］动物穴位图谱及拟人比照法定位，选取大鼠患侧“内关”“曲泽”“合谷”“曲池”穴。“内关”：前肢内侧离腕关节约3mm左右的尺桡骨缝间，刺入约1mm；“曲泽”：肘弯横纹偏内侧凹陷中，刺入约2～3mm；“合谷”：前肢第1、2掌骨之间，刺入约1mm；“曲池”：桡骨近端的关节外侧前方凹陷中，直刺约3～4mm。针刺方法：两经穴组于造模后6、24、48、72h时进行治疗。以32号毫针刺入穴位，接G6805－Ⅰ型电针治疗仪。极性固定，负极接远心端穴位，正极接近心端穴位，采用连续波，频率为20Hz，输出电压2～4V，以局部组织轻颤为度，时间30min。

1．6检测指标大鼠血清VEGF含量的检测：治疗结束后，所有大鼠用10％水合氯醛（0．3mL／100g）腹腔注射麻醉，腹主动脉插管取血5mL，静置30min后离心（3500r／min，20min），用移液枪抽取上清液，严格按照试剂盒的操作说明，应用ELISA法检测血清VEGF的浓度。以标准物的浓度为横坐标，吸光度（OD）值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。VEGF在脑梗死区的阳性表达及微血管密度在镜下的计数：处死大鼠，断头取脑，切取病灶侧脑组织，应用免疫组织化学法检测梗死区脑组织的VEGF表达量及微血管密度。VEGF表达量以吸光度值表示。VEGF在血管内皮细胞的胞质中标记为棕黄色的颗粒，任何被VEGF抗体染成棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇团，视为1个血管计数。应用7001×UVI数字彩色显微图像分析系统，每只大鼠取5张切片，每张切片在同一皮层缺血中心及海马区周边选择3个高倍（×400）视野进行VEGF阳性表达吸光度值测定，参照Weidner［5］计数方法，计算出每1mm×1mm面积内微血管的数量，即微血管密度，然后求其均值。1．7统计学方法数据采用均数±标准差（x珚±s）表示。当资料满足正态分布和方差齐性时，多组组间比较采用方差分析（One－WayANOVA），多重比较采用LSD、Dunnett比较。所有数据均采用SPSS16．0统计软件进行统计。

2结果

2．1各组大鼠血清VEGF含量的比较由图1可知，模型组、心包经穴组、大肠经穴组血清中VEGF高于正常组、假手术组（P＜0．01）；心包经穴组、大肠经穴组血清中VEGF明显高于模型组（P＜0．01）。

2．2各组大鼠脑梗死区VEGF阳性表达量的比较由图2可知，模型组、心包经穴组、大肠经穴组脑梗死区中VEGF阳性表达均高于正常组、假手术组（P＜0．01）；心包经穴组、大肠经穴组脑梗死区中VEGF的表达明显高于模型组（P＜0．01）；心包经穴组脑梗死区中VEGF的表达高于大肠经穴组（P＜0．01）。

2．3各组大鼠脑梗死区微血管密度的比较由图3可知，正常组、假手术组有少量VEGF阳性表达，微血管形成；MCAO模型组在缺血中心及周边区血管内皮、缺血侧软脑膜细胞均有VEGF弱表达，微血管形成；心包经穴组、大肠经穴组上述部位有VEGF强阳性表达，微血管形成。统计结果显示，模型组、心包经穴组、大肠经穴组脑梗死区中VEGF微血管密度均高于正常组、假手术组（P＜0．01）；心包经穴组、大肠经穴组脑梗死区中微血管密度明显高于模型组（P＜0．01）；心包经穴组脑梗死区中微血管密度高于大肠经穴组（P＜0．01）。

3讨论

血管新生（angiogenesis，AG）是缺血区组织的抗损伤和神经元修复的结构基础。研究发现AG可明显改善脑缺血区周围的组织灌注，弥补因血流量不足导致的脑损伤，同时减少神经元的损伤，促进其修复［6］。研究还发现，脑缺血后缺血区和周边组织毛细血管密度增高，微血管形成和侧支循环建立，从而改善局部血流，有助于脑梗死患者缺血的神经功能修复［7－9］。VEGF是目前发现的作用最强的促血管生长因子，对血管内皮细胞有强烈的促分裂和趋化作用。大量的文献研究报道［10－13］，针刺“内关”“足三里”“水沟”“百会”等单穴均能有效地增加脑组织中VEGF及其相关因子的表达，促进血管生成，改善局部脑血流量，达到抗脑缺血损伤的作用。但是对针刺手厥阴心包经穴与其它经对照的研究少见报道。心脑血管疾病是临床常见病、多发病，现代医学认为心、脑之间生理、病理关系密切，二者之间通过神经反射、体液调节等来协调彼此的功能。在临床实践中发现，动脉粥样硬化常为心脑血管疾病共同的病理基础，高血压、高脂血症、吸烟等动脉粥样硬化的危险因素及血液流变学的异常会同时对心脑血管疾病产生影响，故降脂、控制血压、合理使用钙离子拮抗剂既可分别治疗心脑血管疾病，又能同时医治该两类疾病，这也是现代医学治疗“脑心综合征”“心脑综合征”时的主要方法。中医学对心、脑的相关性认识主要在于心主神志、脑为元神之府。因心、脑共为神明之府，又有血脉相通，故“一处神明伤，则两处俱伤”。心脑血管病的病位在于心脑之络脉，其络脉失养、瘀阻络脉的病理改变是一致的，秉承了“异病同治”的理论内涵。我们课题组的前期研究及其它相关研究发现［1，14－16］，针刺能在治疗脑血管病时，特别是在出现了脑心综合征时，通过良性调节体内心脏植物神经均衡性，借助神经－体液系统对心肌产生影响，而达到改变心脏功能的作用。本实验结果表明，脑缺血损伤后机体具有一定的应激性反应，与Lee等［17－18］脑缺血刺激可以一定程度激发机体的应激反应，改善机体的损伤状态的结果相佐证；而电针能促进脑缺血后脑梗死区的血管新生。心包络为心之包膜，与心密不可分。手厥阴心包经“主脉所生病者”。内关为手厥阴心包经络穴，亦为八脉交会穴之一，与阴维脉交会，主阴主血。曲泽是心包经的合穴，可调理心气，促进气血的运行。本实验结果显示，电针心包经穴促进脑梗死区血管新生的作用强于电针大肠经穴，证实了经脉（穴）与脏腑相关间的效应具有相对的特异性，为“心主血脉”的中医理论以及心脑血管皆与“脉”相通的生理机能和现代“心脑相关”“心脑同治”提供了一定的实验依据。