十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长机理的实验研究

【摘要】 目的 研究十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长修复过程中骨痂中TGF-β1,羟脯氨酸、钙、磷;血清中碱性磷酸酶、钙、磷的变化和作用机理。方法 实验用健康日本大白兔81只5~6月龄造成双侧前肢0.7 cm横断性骨缺损,保留尺骨完整,并分成三组,对照组和实验组,空白组不用药,实验组给十味接骨药,对照组给骨折挫伤散。2周、5周、8周分别取材,观察十味接骨药对骨折修复的影响。结果 实验组骨痂中TGF-β1、HRP先升高后递减;血中骨痂中Ca、P峰值提前出现,血中ALP随骨生长逐渐升高。与对照组相比较统计学*P

【关键词】 骨折愈合;骨细胞生长;十味接骨药

Therapeutic Effect of SHI-WEI-JIE-GU-YAO on Experimental Fracture and Its Mechanism

TIAN Qing-shan, SHUI Guo-xing,LI Kun,et al.

Jiamusi College, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Jiamusi, Heilongjiang 154002,China

【Abstract】 Objective To study the effect of SHI-WEI-JIE-GU-YAO in the healing process of fracture. Methods Eighty-one rabbits, aged 5-6 months, had been made experimental fractures at the middle shaft of the humerus bilaterally and divided into 3 groups randomly: the blank control group, fed with common forage; the experimental group, fed with SHI-WEI-JIE-GU-YAO additionally; the drug control group, fed with GU-ZHE-CUO-SHANG-SAN. The specimens were taken out 2, 5, and 8 weeks after operation. The contents of TGF-β1、hydroxyproline、calcium、phosphorus in callus and alkaline phosphatase、calcium、phosphorus in serum were tested respectively. Results All the data showed that TGF-β1, hydroxyproline in calluses of experimental group were raised firstly and descended afterwards, the peak value of calcium and phosphorus appeared in advance compared with other groups (P

【Key words】 Fracture healing; Bone cell growth ;SHI-WEI-JIE-GU-YAO

本院采用活血化瘀加合成微量元素(钙、锌、锰、锡、铜等组成)十味接骨药,临床用于治疗骨折和延迟骨折愈合取得良好的疗效。本文观察家兔造挠骨双侧缺损的动物模型,观察实验组与对照组、空白组骨折修复的疗效研究及评价。

1 材料与方法

1.1 分析仪器 MICROM-HM325型切片机(德国),奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪(日本),HP8452A紫外可见分

作者单位:154002 黑龙江中医药大学佳木斯学院(田青山 隋国兴 田慧敏);

佳木斯大学(栗坤 付正宗);佳木斯东方医院(田力);二二四医院(魏丽)

光光度计(美国惠普公司),MettierH54AR十万分之一分析天平(瑞士),TH2-88-1型多用恒温台式振荡器(江苏太仓鹿河电讯器材厂),80-2离心机(上海手术器械厂)SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科贸有限公司),电热恒温水箱(余姚市电工仪器厂),中科恒业图像分析软件,OLMPUS U-SPT JAPAN DX41奥林巴斯光学免疫显微镜数码相机。主要试剂盒TGF-β1(MSHS上海麦莎生物科技有限公司,工作浓度1:200)DAB显色试剂盒。羟脯氨酸试剂盒一套,由南京建成工程研究所第一分所提供。

1.2 主要药物 十味接骨药,由合成微量元素(钙、锌、锰、锡、铜等组成)。王瓜籽、番木鳖、三七、血竭、生白芍、生甘草、土虫、没药、乳香共为细末,由黑龙江中医药大学佳木斯学院制剂室制备。骨折挫伤散,由哈高科佳木斯中药厂生产。国药准字Z-23021314。批号:200608005。

1.3 动物造模与分组 实验用健康日本大耳白90只。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。合格证号SYSK(黑)20020018•5-6。雌雄兼用,体质量2.5～3.0 kg,随机分成空白组、对照组、实验组。22 mg/kg肌内注射氯胺酮全身麻醉,按无菌原则手术,先刮去术区毛,碘伏消毒脱碘消毒。取双侧前臂挠骨一侧前圆肌止点附近中段造成0.7 cm骨缺损。保留尺骨完整。然后冲洗逐层缝合,不置内外固定,碘伏敷料包扎放笼中,术后庆大霉素3.2万肌肉注射抗感染4 d,术后当天给药随机抽样法。分为空白9只,对照9只,实验63只。

1.4 动物给药 动物造模当天给药实验,空白组常规喂养。对照组给骨折挫伤散0.14 g/(kg•d)。实验组给十味接骨药,高剂量0.106 g/(kg•d)(0.106×2.5×4);中剂量0.106 g/(kg•d)(0.106×2.5×2);低剂量0.106 g/(kg•d)。

1.5 取材和标本处理 给药实验后于14、35、56 d。三组动物按三个时间段进行P-ALP、S-Ca、S-P及骨痂中HRP、Ca、TGF-β1分析,将兔放兔盒中固定,选耳后静脉清晰部位拔除局部绒毛,75%乙醇消毒,摩擦静脉使之扩张,用6号针头在耳后静脉末梢刺破血管,待血渗出后用注射器抽取血液2 ml放不加抗凝剂试管中,用80-Z离心机离心制成血清,然后将兔处死,取骨痂部分待测。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 血样分析 三组动物按三个时间段进行P-ALP、S-Ca、S-P分析,将兔放兔盒中固定,选耳后静脉清晰部位拔除局部绒毛,75%乙醇消毒,摩擦静脉使之扩张,用6号针头在耳缘静脉末稍刺破血管,待血渗出后用注射器抽取血液2 ml放不加抗凝剂试管中,用80-Z离心机离心制成血清,用奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪分析血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)。

1.6.2 骨痂分析 羟脯氨酸(HRP)、钙(Ca)、磷(P)。将新鲜骨痂用丙酮脱脂脱水12 h真空干燥称重,用10%三氯乙酸脱钙脱磷,用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙;用孔雀绿直接显色法测提取液中的磷,剩余骨痂用蒸馏水冲洗,滤纸吸去多余的水分称重,用样本碱水解法测骨痂中的羟脯氨酸。具体做法:①骨痂标本丙酮脱脂脱水,用TH2-88-1型多用恒温台式振荡器振荡3 h后,静置12 h,使脱水完全取出样本置于真空干燥皿中,用SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵真空干燥后,用MettierH54AR十万分之一分析电子天平称重,将干燥样本浸在3 ml,10%三氯乙酸中提取样本中的钙、磷24 h取出样本待用。按试剂盒说明方法测钙、磷;②用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙(Ca)含量,空白管、标准管,测定管中各加1.0 ml甲基百香酚蓝(MTB)试剂和2.0 ml碱性溶液,空白管加20 μl去离子水,标准管加20 μ、25 mmol/L钙标准液测定管中加20 μl待测提取液,分别混匀静置5 min后,波长610 nm、1 cm光径,蒸馏水调零,HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;③用孔雀绿直接显色法测提取液中磷含量,空白管标准管测定管分别加入1 ml尿素溶液2 ml孔雀绿-钼酸液,再空白管中加20 μl去离子水,标准管加20 μl、1.29 mmol/L磷标准应用液,测定管加20 μl待测提取液,分别混匀,室温准确放15 min,640 nm、1 cm光径,蒸馏水调零用HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;④从10%三氯乙酸中取出骨痂样本经蒸馏水冲洗后滤纸吸取多余水份,用电子天平称重(取样本湿重)用样本水解法测羟脯氨酸(HRP)含量。精确称取样本湿重(30～100 mg)后放入试管中,准确加入水解液1 ml混匀加盖后放入沸水浴水解20 min(10 min时混匀一次使水解更充分),然后取出,将各试管流水冷却后,各管加指示剂1滴摇匀。各试管准确加入调PH甲液1.0 ml混匀(此时溶液为红色)用200 μl加样器吸取调PH的乙液向各管逐滴小心加入调PH的乙液,每滴加入后摇匀,直至液中试剂颜色变成黄绿色,此时PH值6.0~6.8左右。再加蒸馏水至10 ml混匀,取3~4 ml稀释的水解液加适量活性炭(约20~30 mg),以上清液离心澄清无色为准。3500转/ min离心机离心10 min,经滤纸滤后,取清液1 ml做检测。空白管、标准管、测定管分别加1.0 ml蒸馏水1.0 ml 5 μg/ ml标准应用液1.0 ml待测定,然后各加0.5 ml试剂混匀,静置10 min,加试剂二0.5 ml混匀,60℃水溶15 min,冷却后,3500转/min,离心机离心10 min,取上清液550 nm波长1 cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度读数。

1.6.3 免疫组化实验微波脱钙。用7.15EDTA液适量,方法:将骨组织放入微波专用盒,根据组织的多少放适量的脱钙液在微波下55℃间歇脱钙,以每次辐射2 min为一脱钙循环,经过反复筛选以30个脱钙循环为最佳脱钙终点,在2个循环之间将标本盒出微波炉外,室温冷却5 min,保证每次辐射中脱钙温度,随时更换新液,5 d后骨组织脱钙完毕,以针灸针能穿透骨组织为脱钙终点。脱钙后福尔马林溶液常规固定24 h,常规梯度乙醇脱水75%~100%乙醇,各脱水6 h。二甲苯透明1 h,60℃ 恒温箱浸腊分别1 h、0.5 h。石腊包埋,作3 μm切片裱片,脱腊至水,一部份做HE染色,一部份做S2P(链霉素菌抗生蛋白过氧化物酶)染色。(4)S2P染色检测:30%过氧化氢孵育15 min,清除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水冲洗0101 molpL PBS浸泡5 min×3次;微波炉修复抗原10 min;0101 molpl PBS浸泡5 min×3次;抗原修复室温10 min;倾去修复液,滴加30 μl按一定倍数稀释的一抗(1:200),40℃过液;0101 mo1PL PBS浸泡5 min×3次;滴加生物素标记的二抗(1:150)30 μl,37℃孵育30 min;0101 molpL PBS浸泡5 min×3次;辣根酶标记的链酶卵白素(1:150)30?l;37℃孵育30 min;0101 molpL,PBS浸泡5 min;DAB显色5 min,自来水充分水洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,DPX封片。(5)HE染色检测:常规二甲苯脱蜡至水(二甲苯脱腊5 min×1次,二甲苯脱腊5 min×2次;二甲苯脱蜡5 min×3次,100%乙醇脱苯5 min×2次;95%乙醇脱苯5 min×2次,90%乙醇脱苯5 min×1次,85%乙醇脱苯数秒,自来水冲洗数秒)。苏木素细胞核染色10 min自来水冲洗数秒,10%盐酸乙醇分化数秒,背景无色温水蓝化10 min;伊红30 s胞浆染色。梯度乙醇脱水(80%乙醇数秒,85%乙醇数秒,90%乙醇数秒,95%乙醇5 min×2次,100%乙醇5 min×2次)。二甲苯透明5 min×3次,二甲苯透明5 min×2次。中性树胶封片。

1.7 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件包,计量以x±s表示,二组间比较用t检验,多组比较用方差分析。

2 结果

2.1 血液化学分析(x±s)三组动物的碱性磷酸酶、钙、磷有明显差异。实验组动物碱性磷酸酶、钙、磷变化明显高于对照组和空白组,随着骨折修复的逐渐完成其改变随之增高。5周时达到高峰,碱性磷酸酶显著升高,钙磷乘积峰值升高。说明十味接骨药能提高动物成骨细胞的成骨活性和促骨基质合成作用。能促钙盐沉积过程超前出现,对骨化骨塑形,促骨愈合起到重要作用。对照组、空白组、实验组动物有相似钙、磷、碱性磷酸酶含量先递增,随着骨修复又递减规律,实验组与对照组统计学差异显著,看出十味接骨药有促进骨修复区内骨痂生长和钙化的作用。(见表1)。

表1

血液生化分析结果(x±s,mmol/L)

时间N

二周五周八周

s-Cas-Pp-ALPs-Cas-Pp-ALPs-Cas-Pp-ALP

对照组62.88±0.971.17±0.2365.33±21.593.145±0.441.53±0.5282±21.423.06±0.431.62±0.5657.83±1.83

空白组61.93±0.211.01±0.0136.5±5.361.95±0.211.11±0.1067.2±11.032.54±0.121.02±0.0238.33±3.98

实验组153.56±0.501.46±0.2891.47±27.913.47±0.192.42±0.62110.8±28.383.43±0.132.28±0.3877.60±17.04

注:与对照组比较*P

2.2 骨痂TGF- β1染色阳性结果(x±s) 动物骨折2周时,实验组连接骨痂已形成,成熟的软骨细胞内TGF-β1,阳性细胞染色增强,对照组只见少量纤维细胞,软骨细胞成骨细胞分化趋势,TGF-β1浅淡染色,骨痂连接极少。5周时,实验组断端大部分连接,软骨痂向硬骨痂转化,成熟软骨中TGF-β1阳性染色强度增加,对照组骨痂初步连接,TGF-β1阳性染色如实验组2周表现。8周实验组断端完全连接,软骨痂极少,骨小梁间隙减少,联合片状骨板形成,骨陷窝成骨活动减少,TGF-β1染色变浅淡,而对照组出现实验组5周时的表现。说明十味接骨药结TGF- β1因子有促分泌合成促骨愈合作用,TGF- β1骨折2周时染色强度逐渐升高,5周成骨细胞活跃时达染色强度高峰,随着骨修复TGF- β1逐渐降低的骨生长规律。对照组TGF-β1染色均值较实验组低(P

表2

骨痂TGF- 染色阳性细胞结果(x±s)

组别N2周5周8周

对照组66.5±1.411.0±4.68.2±3.1

实验组1213.9±4.525.2±11.924.5±10.98

注:与对照组*P

实验动物骨痂中钙、磷、羟脯氨酸分析测得,实验组高于对照组、空白组,统计学差异明显,而实验组羟脯氨酸随着骨修复的完成而呈递进升高。证明十味接骨药能使骨痂中羟脯氨酸增加,使骨胶原蛋白合成分泌增加,从而能激活骨修复细胞活性促骨愈合加快。三组动物骨痂钙磷呈递增规律,实验组和对照组与空白组统计差异显著,说明十味接骨药有促进骨痂生长和钙化的良好作用,(见表3)。

表3

骨痂羟脯氨酸、钙、磷分析结果(x±s,1 mg/mg)

时间N

二周五周八周

HRPCaPHRPCaPHRPCaP

对照组610.6±1.13.2±3.467.7±26.910.2±4.73.8±2.972.2±41.413.1±3.04.5±3.957.0±14.9

空白组610.0±0.72.6±1.877.1±13.81.4±0.23.1±3.369.2±17.010.4±0.21.4±0.435.4±33.7

实验组1514.1±2.17.1±1.895.4±13.015.8±1.57.9±1.6110.2±21.617.9±1.08.9±1.8114.0±15.6

注:与对照组*P

图1 骨痂TGF-β1染色阳性细胞两周结果

验组连接骨痂已形成,如图1a、图1b(S2P×400)可见 TGF-β1染色增强呈阳性,间充质细胞增殖活动向成纤维细胞、软骨细胞、分化趋势。

图2 骨痂TGF-β1染色阳性细胞五周结果

实验组TGF-β1染色进一步增强,图2a(S2P×400)软骨痂向硬骨痂转化,大部分已形成连接,TGF-β1染色由强渐减弱趋势。对照组染色,如实验组两周时表现,成骨细胞、软骨细胞增加,图2b(S2P×400)。

图3 骨痂TGF-β1染色阳性细胞八周结果

实验组TGF-β1染色进一步浅淡,骨痂减少,骨小梁间隙减少,骨板联合成片,骨陷窝活动成骨活动明显减少,图27(S2P×400)。对照组此期如实验组五周时表现,图29(S2P×400)。

3 讨论

分析十味接骨药组成,由乳香、没药、三七、血竭、土虫组成活血化瘀;番木鳖、合成微量元素,王瓜籽消肿止痛和胃,补充人体必须的微量元素和激发骨生长因子及合成胶原氨基酸物质,白芍、甘草、甘酸化液缓急止痛,这是十味接骨药促骨愈合的物质基础。

十味接骨药,具有对全身及骨折局部有较强的活血化瘀作用。活血化瘀可使骨折骨内外膜局部得到足够的血供,为骨折愈合提供了充足的物质营养基础。活血化瘀药物,能降低骨折处毛细血管通透性减少渗出,促血管重建,使局部血运加快,能降低血粘度及血细胞集聚,排除局部血运障碍,改善局部微循环,缩短炎性反应期,尽早启动骨折修复过程。给骨折愈合创造了良好的生长环境,血供是维持生命器官的活力及组织修复的关键。有跌伤骨折,宜以活血化瘀为先,血不活则瘀不去,瘀不去则骨不接也[1]。十味接骨药,能促进血液循环和局部微循环加快,使新生血管长入缺损区并激发修复相关因子活跃,形成修复的良好基础,是加速修复的重要因素。微循环的改善,微量元素矿物质的补充,对机体内某些物质进行调节,进而增加矿物质在骨中的沉积矿化完成修复骨折的作用。

十味接骨药,对碱性磷酸酶(ALP)有明显影响,骨折后2周碱性磷酸酶(ALP)显著升高,碱性磷酸酶是由成骨细胞分泌,其通过在钙化区对磷酸脂的水解作用释放出磷酸阴离子,在胶原骨架上启动钙化过程[2]。碱性磷酸酶(ALP)升高说明成骨细胞的成骨活性升高,给骨盐沉积创造了先决条件,是促骨愈合的积极因素。提高成骨细胞的活性,促进胶原蛋白的合成,调节相关糖蛋白的代谢,对骨折修复时的骨痂和骨化有重要意义。从而看出十味接骨药,对动物造膜后新骨形成增加骨小梁的面积,促骨基质合成,起到积极的作用。

含微量元素的十味接骨药,在骨折修复中的作用。锌锰是肾的物质基础,这类补肾药可提高体内雌激素水平,刺激1.2羟化酶的活性,使1.25(OH)2D3增加的作用。十味接骨药,能兴奋丘脑下部垂体-肾上腺轴,从而调节钙磷上升,刺激甲状腺分泌降钙素,促进成骨细胞活动,有利钙盐在骨折修复时沉积。中医治病作用机制主要是活性分子和微量元素在体内起着互相协同,互相制约的作用,并参与体内各种生化反应。促进体内自身调节,趋求新的阴阳平衡,从而达到治疗目的[3]。铜是许多金属酶的组成成份,作为胶原蛋白和弹力蛋白合成所必需的微量元素,铜在骨折的修复中可能起着某些重要作用。同时铜又是许多抗氧化酶的组成部分,如铜蓝蛋白,铜锌超氧化物岐化酶等[4]。中药的微量元素大多以天然络合物形势存在,它们是以本身络合物形势,在复方配伍过程中在体内形成络合物的形势发挥疗效。

十味接骨药,以活血化瘀中药及极少量微量元素组成,应用于动物身上,它们以天然的络合和动物自身生理生化的一系列反应对骨伤进行治疗方面取效。对骨折早期有促破骨细胞活跃作用,对骨折端进行溶骨作用,放钙入血,而使血钙升高,促进甲状腺分泌降钙素上升,促进成骨细胞活跃,增加钙盐沉积,利于骨折修复,血中骨中两个系统钙磷,常维持平衡状态,血钙升高相对血磷下降,血钙下降血磷升高。十味接骨药,又进一步刺激甲状腺分泌降钙素而促成骨细胞活跃使血钙降低,从而降血钙升血磷,使血钙磷乘积峰值超前出现,促钙盐沉积过程提前形成,提前出现骨化塑形骨形成增快,促骨愈合的作用。在实验中,实验组血清中钙磷乘积峰值要比对照组早出现3周,骨痂中钙磷乘积峰值要高于对照组,说明十味接骨药对血中骨中钙磷有明显提高作用,有促骨痂生长和钙化作用。从而可以看出,十味接骨药是按生命物体自身规律在多种酶和蛋白质作用下进行分解氧化吸收利用排毒完成每个规律活动周期,使机体必须的微量元素,以及有毒的微量元素和不必须的微量元素,调整到生理需要平衡状态,达到治愈骨折的目的。

十味接骨药,能刺激TGF-β1活跃,能诱导骨折愈合,它的分泌旺盛给骨折愈合奠定了先决条件和物质基础。骨和血小板中TGF-β1的含量最为丰富,在骨折修复过程中,一方面血小板通过脱颗粒作用向骨折处释放高浓度TGF-β1,刺激相邻的骨细胞增生和增加基因蛋白的合成。另一方面骨折局部的修复细胞自身合成并分泌TGF-β1,并刺激这些细胞功能活跃,这样以自身分泌和旁分泌的方式调节骨折愈合不同阶段的细胞功能,从而促进骨折愈合[5]。在骨折愈合早期,便有骨端骨膜反应,由骨膜生发层细胞分化,增殖而形成成熟的骨细胞,TGF-β1在此时其对骨膜生发层细胞及成熟的骨细胞均有表达,说明其对骨膜生发层细胞定向分化为成骨细胞,以及成骨细胞的成熟起重要作用。TGF-β1 是激发骨折修复的重要诱导因子,TGF-β1的表达随骨细胞的成熟肥大而衰减的同时,此时又在成骨细胞内旺盛分泌刺激着骨基质的形成、沉积,直至骨性愈合[6]。实验中,实验组与对照组修复中 TGF-β1的表达,实验组始终比对照组提前3周,说明十味接骨药疗效确切。

羟脯氨酸,在骨痂生长中的升高,是促进骨断端胶原蛋白尽早形成不可缺少的重要物质,对加速骨修复很重要。当骨痂中羟脯氨酸含量增加,可加速骨折愈合,能激活骨修复细胞的活性,促进了对胶原的合成分泌,使骨的断端胶原增加,对骨折愈合提供了良好的基础。

实验中HRP,随骨修复逐渐升高规律,实验组高于对照组,说明十味接骨药能使动物骨折修复中HRP增加,使骨胶原蛋白合成分泌增加,促骨愈合加快的作用。实验中看出十味接骨药能提高成骨细胞的活性,促进胶原蛋白合成促进骨痂区钙化进程加快,从而对骨修复有明显作用的机理。

参 考 文 献

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