靶向HER?2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究

【摘要】 目的 研究以her2 mrna为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（s?odns）ha6722对her?2过表达乳腺癌细胞株mda?mb?453体外增殖的抑制作用，及ha6722对肿瘤细胞her?2表达的影响。方法 选择her2过表达的mda?mb?453细胞与her2低表达的mda?mb?231细胞，mtt法观察s?odns对肿瘤细胞增殖的影响，免疫细胞化学（icc）与rt?pcr方法研究s?odns对细胞her2蛋白及mrna表达的影响。结果 ha6722可以剂量依赖方式抑制mda?mb?453细胞的体外增殖，ic50值（41.8±8.1nmol·l-1, n=5, mean±s）显著低于对照序列scramble6722（ic50=489.4±12.1nmol·l-1, n=5, p<0.01）。ha6722在蛋白水平与mrna水平显著抑制mda?mb?453细胞中her?2的表达；ha6722对mda?mb?231细胞的体外增殖无显著影响（ic50=476.7±17.6 nmol·l-1, n=5，p＞0.05）。结论 ha6722可序列特异性地抑制her?2过表达乳腺癌细胞的体外增殖，其抑制增殖作用与靶细胞her?2表达下调有关。

【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 her2 mrna

0 引言

乳腺癌的发生、发展涉及多基因的异常。her2/neu（又称cerbb?2）基因的异常扩增见于30%左右的乳腺癌患者。现已明确，her2/neu基因的异常扩增或her2受体的过表达是一种不良的预后指标[1]。反义疗法是在转录水平以反义寡核苷酸特异性结合靶mrna，激活rnase h，降解mrna, 阻断相应功能蛋白的表达。有研究表明[2，3], 反义寡核苷酸可以抑制her2受体的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。本研究采用本研究室设计合成的her2特异性硫代反义寡核苷酸ha6722，观察了其对不同her2表达水平的乳腺癌细胞株增殖活性的影响，并在mrna和蛋白水平观察了其对her2的影响。

1 材料与方法

1．1 细胞系及培养

本研究采用的细胞株有：mda?mb?453（her2过表达），细胞培养所需的培养基为l15（gibco,brl）内含10%的胎牛血清（fcs，hyclone），置37℃、不含co2的培养箱中培养；mda?mb?231（her2低表达）的体外培养采用rpmi?1640（gibco,brl）培养基，内含10%的胎牛血清（fcs，hyclone）,置37℃、含体积分数为5%的co2培养箱中培养传代。

1．2 硫代反义寡核苷酸的合成

靶向her2 mrna反义寡核苷酸ha6722、scramble6722序列均为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：

ha6722： 5′cag cag ccg agc cag ccc ga3′

scramble: 5′tcg ggc tgg ctc ggc tgc tg3′

琼脂糖凝胶电泳结果表明上述反义寡核苷酸纯度符合要求。上述反义寡核苷酸以无血清无抗生素的l?15或rpmi?1640培养基溶解成浓度为25μmol·l－1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。

1．3 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, mtt）法检测细胞活性 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（costar,usa）,接种数量分别为：mda?mb?453 5×104cells/孔、mda?mb?231 2×104cells/孔，为避免“周边效应”，培养板的周边孔弃用。待细胞生长至80%～90%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的ha6722, scramble6722等硫代寡核苷酸转染细胞4～6h，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的mtt溶液（0.5mg/ml）200μl, 细胞在37℃，含有5 %（mda?mb?453细胞的培养不需co2）的培养箱中继续孵育4h，吸去mtt溶液，每孔加200μl dmso, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（od值）。

1．4 免疫细胞化学

以脂质体（lipofectaminetm 2000, invitrogen）2000将终浓度为200 nm 的ha6722, scramble6722对照序列转染mda?mb?453及mda?mb?231 36h后，以免疫组化方法检测her2受体表达。具体方法见免疫组化试剂盒操作说明（中山公司）。简言之，将细胞涂片在枸橼酸缓冲液(6.4m枸橼酸二钠，ph 6.0)中以 95℃ 15min进行抗原修复，室温下冷却20min，用tris 缓冲液（ph 7.6）冲洗涂片3min×3次，然后过氧化氢室温封闭5min，再按上述方法洗涤。涂片在37℃下用her2单克隆抗体(鼠抗人，santa cruz, usa)孵育60min，再用二抗 (羊抗鼠，santa cruz, usa)以同样的条件孵育30min。 用缓冲液冲洗切片3min×3次，再用铬精底物溶液(3, 3’?二氨基联苯胺)进行核染色。最后以苏木精染色计算着色深度。着色深度分为0 (基本等同于阴性染色), 1+ (轻度着色), 2+ (中度着色)及3+ (重度着色)。

1．5 逆转录多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, rt?pcr）

以浓度为200nmol·l-1的 硫代反义寡核苷酸ha6722、scramble6722序列分别转染mda?mb?453、mda?mb?231乳腺癌细胞24小时后，遵照试剂说明书（rna rt?pcr试剂盒，广州 璐晶）提取细胞总rna，backman紫外分光光度计测定光吸收值（od值），计算rna含量。人类特异的her?2及内标(glyceraldehydes-3-phosphate，g3pdh) 引物如下：

her?2 上游： 5’caa tgg aga ccc gct gaa c3’; 下游: 5’cag tgc gcg tca ggc tct 3’

g3pdh 上游: 5’acc aca gtc cat gcc atc ac 3’; 下游: 5’tcc acc acc ctg ttg ctg ta 3’

引物由北京赛百盛公司合成。反应条件为：反转录及第一次循环：预变性1循环 55℃ 30min， 94℃ 2min；pcr 30个循环：94℃ 25sec，56℃ 30，72℃ 35sec；产物扩增及第二次循环：94℃ 1min；pcr 30个循环：94℃ 25sec，56℃ 30sec，72℃ 35sec；最后是2min的延伸。反应产物在1.2%的琼脂糖 (gibco) 凝胶中进行电泳，之后在紫外灯下扫描拍照；上述细胞在不经硫代反义寡核苷酸转染的情况下，分别提取rna，按同样方法操作，以检测her?2 mrna的基础表达水平。

1．6 统计学处理

采用spss10.0统计分析软件进行统计学处理，均数比较采用student’s t检验。

2 结果

2．1 ha6722及其对照scramble6722对mda?mb?453及mda?mb?231细胞系的ic50比较,见表1。

2．2 ha6722及其对照对两种细胞增殖活性的影响表1 ha6722对两种乳腺癌细胞系的ic50比较与ha6722 mda?mb?453相比，t=74.3, p＜0.05; 与scrambl6722相比，t=1.33, p＞0.05 不同浓度ha6722、scramble6722作用于对数生长期的细胞72h之后，前者可以显著抑制her2过表达细胞mda?mb?453细胞的增殖，而且此种作用随着浓度的增加而增强；同样浓度的ha6722对her2低表达的mda?mb?231细胞却没有相应的抑制作用, 见图1。

2．3 ha6722对mda?mb?453细胞her2受体表达影响

免疫细胞化学方法显示，经80～200nmol·l－1浓度ha6722处理24～48h后，mda?mb?453细胞her2蛋白水平呈现明显的下调，从基础水平的3+染色减低到200nmol·l－1浓度处理后几乎阴性的状态,见图2。

2．4 ha6722对mda?mb?453细胞her2 mrna表达影响

rt?pcr方法显示，经ha6722处理后，mda?mb?453细胞her2 mrna呈现下调趋势，而且随着ha6722浓度增加，这种下调越趋明显，当ha6722浓度达到200nmol·l－1时，her2 mrna几乎受到了完全的抑制，而对照寡核苷酸scramble及random对her2 mrna的表达几乎没有影响, 见图3、4。

3 讨论

her2/neu的过表达与乳腺癌的生物学行为关系十分密切。有研究表明，以her2 mrna为靶点的反义寡核苷酸可以特异性抑制her2/neu过表达乳腺癌细胞的生长，甚至比her2受体的单抗更为强大[4]。针对不同基因的反义药物研究，近年来呈现快速发展的趋势，并显示出诱人的发展前景[5]。以bcl?2等基因为靶点的反义药物已有大量的研究，如g?3139已在体外及体内研究中均显示出明确的抗肿瘤作用[6，7]，并可增强细胞毒药物的抗肿瘤效果[8]

有作者发现，以her2为靶点的反义寡核苷酸ha824对her2过表达乳腺癌细胞sk?br?3体外增殖具有抑制作用[9]。是否具有序列特异性抑制肿瘤细胞生长的作用，是衡量反义药物优劣的重要指标。本研究中，我们以另一种her2过表达乳腺癌细胞株mda?mb?453细胞为对象，对本研究室设计合成的反义寡核苷酸ha6722进行体外抗乳腺

癌增殖作用及其机理的研究。结果表明，ha6722对her2/neu过表达乳腺癌细胞mda?mb?453细胞的抑制呈现良好的剂量依赖性，而对her2/neu低表达的mda?mb?231细胞却没有相同的作用。

her2/neu过表达乳腺癌细胞的生长有赖于持续高水平的her2受体激活，而her2受体的下调将阻断细胞生长的信号传导通路。本研究表明ha6722对mda?mb?453细胞her2受体及mrna表达呈现剂量依赖性下调，而具有相同碱基组成的scramble及随机序列对her2 mrna几乎没有影响。

【参考文献】

［1］ pegram md, finn rs, arzoo k, et al. the effect of her?2/neu overexpression on chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells［j］. oncogene，1997， 15(5):537?547.

［2］ yang sp, song st, song hf.advancements of antisense oligonucleotides in treatment of breast cancer［j］. acta pharmacol sin， 2003，24(4):289?295.［3］ weiss rh, marshall d, howard l, et al. suppression of breast cancer growth and angiogenesis by an antisense oligodeoxynucleotide to p21(waf1/cip1)［j］. cancer lett， 2003，189(1):39?48.

［4］ roh h, pippin ja, green dw, et al.oncolgene［j］． 2000， 19(53):6138?6143.

［5］ pirollo kf, rait a, sleer ls, et al. antisense therapeutics: from theory to clinical practice［j］. pharmacology ＆ therapeutics， 2003, 99(1):55?77.

［6］ nahta r, esteva fj. bcl?2 antisense oligonucleotides: a potential novel strategy for the treatment of breast cancer\[j\]. semin oncol,2003,30(5 suppl 16):143?149.

\[7\] morris mj, tong wp, cordon?cardo c, et al. phase ⅰtrial of bcl?2 antisense oligonucleotide(g3139) administered by continuous intravenous infusion in patients with advanced cancer［j］.clin cancer res，2002，8(3):679?683.

［8］ tanabe k, kim r, inoue h, et al.antisense bcl?2 and her?2 oligonucleotide treatment of breast cancer cells enhances their sensitivity to anticancer drugs［j］. int j oncol， 2003，22(4):875?881.