小菜蛾PxALP1基因的克隆与生物信息学分析

摘要：小菜蛾是一种世界性分布的重要农业害虫，也是最早对无公害生物农药Bt毒素产生抗性的种群之一。已有研究显示，在多种昆虫体内碱性磷酸酶是Bt毒素蛋白的直接受体，但在小菜蛾中，碱性磷酸酶的编码基因及其生物学功能尚极少有人研究。本研究克隆了小菜蛾pxalp1基因的开放阅读框（ORF），并推导出其氨基酸序列。经SMART网站分析，发现该蛋白质在第79～513位氨基酸残基区域存在典型的alkPPc（alkaline phosphatase homologues）结构域；经SWISS-MODEL同源模建预测蛋白质三级结构，发现该蛋白质具有典型的跨膜结构域，说明它是一个潜在的膜结合碱性磷酸酶。通过进化树分析，发现小菜蛾PxALP1与鳞翅目昆虫家蚕膜结合碱性磷酸酶的亲缘关系最近，BLAST比对发现PxALP1与家蚕BmAlpm在氨基酸序列上的一致性（identity）为36.3%，相似性（similarity）为50.3%，说明二者之间具有较好的进化保守性。

关键词：小菜蛾；ALP1；碱性磷酸酶；生物信息学分析

中图分类号：S433.4∶Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）01-0007-06

Abstract The diamondback moth， Plutella xylostella （L.）， is one of the world wide agricultural pests of cruciferous vegetables， and is also one of the earliest populations which produce resistance to pollution-free biological pesticide Bt toxin. The membrane bound alkaline phosphatase has been shown to be a direct receptor of Bt toxin protein in many insects according to previous studies. However， the coding genes and biological functions of Plutella xylostella alkaline phosphatase is rarely known. In this study， the open reading frame （ORF） of PxALP1 gene was cloned and the protein primary structure was deduced. A classic alkPPc （alkaline phosphatase homologues） domain was found in the 79th～513th amino acid residue by SMART analysis， and a membrane bound domain was found through SWISS-MODEL homology model construction. Both of them indicated that PxALP1 was a potential membrane bound alkaline phosphatase. Phylogenetic analysis showed that diamondback moth PxALP1 and membrane combine alkaline phosphatase of Lepidoptera insect silkworm had the closest relationship. BLAST aligning exhibited that the identity between PxALP1 and silkworm BmAlpm was 36.3% and the similarity was 50.3%， which proved that there was high conservation between them.

Keywords Plutella xylostella； ALP1； Alkaline phosphatase； Bioinformatic analysis

小菜蛾[Plutella xylostella （L.）]儆诹鄢崮浚Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），被认为是一种分布最广泛的世界性重要农业害虫[1-3]，主要为害甘蓝、花椰菜、芥菜、白菜、油菜和萝卜等十字花科蔬菜[4]，已经成为世界十字花科类蔬菜生产与发展的极大障碍。在我国，小菜蛾广泛分布于全国各地，且危害日趋严重，由于其具有发生世代多、繁殖能力强、寄主范围广、抗药性水平高等特点，给防治工作带来极大的困难。目前国内对于小菜蛾的防治仍主要以化学防治为主，但由于各种化学农药大量频繁使用导致的耐药性以及化学农药残留导致的环境污染等问题越来越严重，迫切需要人们开发无公害的生物农药。

Bt毒素蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在其芽孢形成过程中产生的一种杀虫晶体毒素蛋白，对鳞翅目、同翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目和直翅目等多个目的昆虫以及原生动物、螨类、线虫等都具有特异性的杀虫活性[5]，是目前世界上应用最广、产量最大的微生物杀虫剂[6-8]。将编码Bt毒素蛋白的基因转入到许多重要的经济作物中可以有效防治包括小菜蛾在内的多种农业害虫[9]，但随着Bt毒素的大量长期使用以及转Bt作物的广泛种植，农业害虫长期处于选择压力之下，从而导致它们普遍对Bt毒素具有了一定的抗性，这种现象在小菜蛾中尤为严重，大大限制了Bt毒素的应用[10-12]。

有研究显示，类钙粘蛋白、氨肽酶N和碱性磷酸酶是Bt毒素蛋白在昆虫体内的直接受体；另外，有研究显示糖脂（glycolipid）和负责体内物质运输的ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）也可以与Bt毒素蛋白直接结合，是其在生物体内的直接受体之一。大量研究显示在烟芽夜蛾（Heliothis virescens）[13]、棉铃虫（Helicoverpa armigera）[14]、烟草天蛾（Manduca sexta）[15]和埃及伊蚊（Aedes aegypti）[16]等生物体内，碱性磷酸酶均是Bt毒素蛋白的直接受体之一，其在它们对Bt毒素蛋白的抗性过程中发挥着重要作用。但是，人们目前尚不清楚重要农业害虫小菜蛾中的碱性磷酸酶编码基因，也不清楚它是否参与了小菜蛾对Bt毒素蛋白的抗性过程。基于此，我们对小菜蛾碱性磷酸酶基因PxALP1进行克隆，并根据基因序列推导其蛋白质一级结构，然后用SMART软件分析预测该蛋白质的结构域，并通过BLAST研究了该蛋白与家蚕碱性磷酸酶BmAlpm蛋白之间的同源性，目的在于证明它们在进化上的保守性，为下一步深入研究PxALP1基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本试验所用小菜蛾为天津市植物保护研究所室内饲养的敏感种群，用无虫甘蓝苗继代饲养20代以上，取四龄幼虫供试。

1.2 主要试剂

Trizol、SuperScript cDNA合成试剂盒和引物购自Invitrogen公司，Taq酶、dNTPs、pGEM-T载体和E. coli DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ购自NEB公司，DNA纯化回收试剂盒、琼脂糖、蛋白胨、氨苄青霉素、X-gal、IPTG、DEPC和质粒小提试剂盒等购自北京天根生化科技公司。

1.3 引物设计

根据小菜蛾基因组数据库[7]DBM-DB（Diamondback moth Genome Database）提供的Px006009基因序列，在其开放阅读框（ORF）两侧各设计一条引物，由Invitrogen公司合成。上游引物为PxALP1-F：5′-TGACTTCGCTGGTGGATTG-3′，下游引物为PxALP1-R：5′-TGTCGTTCTTGAGCAGTATGG-3′。

1.4 小菜蛾总RNA的提取、cDNA第一链的合成及PxALP1基因的克隆

取小菜蛾幼虫100 mg，用液氮冷冻研磨后，用Trizol法提取小菜蛾总RNA，具体步骤参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书，最后溶解于 30 μL DEPC水中，用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，将其直接用于RT-PCR或-80℃保存。

取1 μg总RNA，参照Invitrogen公司的SuperScript cDNA合成试剂盒说明书，以Oligo（dT）18作为逆转录引物合成cDNA第一链。

以cDNA为模板，使用引物PxALP1-F和PxALP1-R进行PCR反应，反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统下拍照。

1.5 pGEM-PxALP1重组质粒的构建及基因测序

将上述PCR产物经DNA纯化回收试剂盒回收，取100 ng与25 ng pGEM-T载体在16℃下连接4 h，将连接产物转化到E. coli DH5α感受态细胞，在LB+Amp平板上通过蓝白斑筛选转化子，挑取3个白斑转化子接种到液体LB+Amp培养基中扩增培养，使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，将这3个重组质粒利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切检测，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统下拍照。将酶切正确的重组质粒送华大基因公司进行测序。

1.6 PxALP1基因的序列分析与蛋白质结构预测

小菜蛾基因组数据库DBM-DB的网址是http：///dbm/；分析DNA测序结果的软件是Chromas；通过PxALP1 ORF序列推导其蛋白质一级结构的软件是Vector NTI；分析预测蛋白质功能结构域的网站是http：//smart.embl-heidelberg.de/；分析预测蛋白质三级结构的网站是http：///。

1.7 系统进化树的构建

将PxALP1的氨基酸序列与源自NCBI的19种昆虫的膜结合碱性磷酸酶序列构建系统进化树。使用的构树软件为MEGA5[17]，用ClustalW进行氨基酸序列比对，基于比对后的序列使用最大简约法（maximum parsimony）构建进化树。随机加入分类单元，1 000次重复，其他为默认参数。

1.8 序列同源性比较

利用Vector NTI软件中的Align选项进行BLAST分析，比较PxALP1与家蚕BmAlpm蛋白的氨基酸序列同源性。

2 结果与分析

2.1 PxALP1基因的克隆

将Trizol法提取获得的小菜蛾四龄幼虫mRNA进行逆转录反应，获得cDNA。以cDNA为模板，使用本试验设计的PxALP1-F和PxALP1-R引物进行PCR扩增，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，得到一条大小约1.5 kb的单一条带，说明成功获得了PxALP1基因片段。

2.2 重组质粒的构建与基因测序

将PCR扩增产物与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，在LB+Amp平板上通过蓝白斑筛选得到多个转化子，挑取其中3个转化子进行扩增培养，提取重组质粒并利用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，3个转化子质粒都出现约3.0 kb和1.5 kb两条带，其中约3.0 kb的DNA条带是pGEM-T载体，约1.5 kb的DN段是插入片段。⒄3个pGEM-PxALP1重组质粒送交华大基因公司测序，分析测序结果发现插入片段均为一段1 560 bp的DN段。将该DNA序列与小菜蛾基因组数据库中提供的Px006009基因ORF序列进行比对，发现二者之间无编码氨基酸水平的差异。

2.3 PxALP1的氨基酸序列分析与蛋白质结构预测

根据测序所得PxALP1 ORF序列推导出了PxALP1的蛋白质一级结构，发现该基因编码一个含有519个氨基酸残基的蛋白质。将PxALP1蛋白的一级结构输入到SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/），分析预测该蛋白质的功能结构域，发现该蛋白在第79～513位氨基酸残基区域存在着一个典型的alkPPc（alkaline phosphatase homologues）结构域，说明它是一个潜在的的磷酸酶，如图3所示。将该蛋白序列在SWISS-MODEL平台（http：///）进行同源模建，预测其三级结构，发现它具有典型的跨膜结构域，结果见图4。这些结果说明PxALP1编码一个潜在的膜结合碱性磷酸酶。

2.4 进化树分析

基于20N昆虫的碱性磷酸酶氨基酸序列比对构建系统进化树（图5），结果显示小菜蛾PxALP1与鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）的膜结合碱性磷酸酶蛋白属于同一个簇，进化关系最为接近；与半翅目昆虫茶翅蝽（Halyomorpha halys）的膜结合碱性磷酸酶蛋白的亲缘关系也比较接近；而与膜翅目昆虫西方蜜蜂（Apis mellifera）和大蜜蜂（Apis dorsata）的膜结合碱性磷酸酶蛋白的亲缘关系较远。

2.5 序列同源性比较

为了研究PxALP1基因在进化上的保守性，利用BLAST比较了小菜蛾PxALP1蛋白与家蚕BmAlpm蛋白的氨基酸序列同源性。结果如图6所示，小菜蛾PxALP1蛋白与家蚕BmAlpm蛋白在氨基酸序列上的一致性（identity）为36.3%，相似性（similarity）为50.3%，说明它们之间具有较好的保守性。且二者间的同源序列主要集中在其碱性磷酸酶alkPPc结构域，进一步预示着二者在功能上也可能具有较好的相似性。

3 讨论与结论

昆虫碱性磷酸酶ALP一般可分为膜结合ALP和可溶性ALP两种[13]，其中膜结合ALP定位在昆虫肠道表面，通过GPI铆钉在肠道细胞的细胞膜上，因此也被称为GPI铆钉ALP。Bravo等[18]在Bt毒蛋白杀灭昆虫机制的孔道形成假说中提出，膜结合ALP能够与活化的毒素单体直接结合，并导致其在中肠微绒毛细胞上大量富集，进而插入脂阀膜形成孔道，改变细胞的渗透压导致细胞肿胀死亡。

大量研究显示，膜结合ALP在烟芽夜蛾[13]、棉铃虫[14]、烟草天蛾[15]和埃及伊蚊[16]等多种双翅目、鞘翅目和鳞翅目昆虫中都被鉴定为是Bt毒蛋白的直接受体，但在重要农业害虫小菜蛾中，膜结合ALP尚很少有人进行过研究。小菜蛾基因组测序的完成为小菜蛾基因功能的研究提供了强有力的工具。前期，我们检索小菜蛾基因组数据库共发现了7个碱性磷酸酶编码基因（Px000029、Px006009、Px009112、Px014125、Px014338、Px017537、Px017797），为了寻找其中可能为Bt毒蛋白直接受体的膜结合碱性磷酸酶基因，我们使用烟芽夜蛾膜结合ALP蛋白HvmALP1的氨基酸序列在小菜蛾全基因组数据库中运行BLAST，结果发现与HvmALP1同源性最高的为Px006009，说明Px006009基因最可能编码小菜蛾膜结合ALP，因此将该基因命名为PxALP1。

本研究克隆了小菜蛾PxALP1基因，通过功能结构域分析和蛋白质三级结构预测发现它具有典型的alkPPc结构域和跨膜结构域，是一个潜在的膜结合ALP；通过系统进化树分析和同源性比对发现它与其它鳞翅目昆虫的膜结合ALP之间具有很好的序列相似性和进化保守性，暗示小菜蛾PxALP1可能是Bt毒蛋白的直接受体。本研究为进一步深入探讨小菜蛾PxALP1基因的功能、揭示PxALP1蛋白是否为Bt毒素在小菜蛾体内的直接受体奠定了基础，同时为开发小菜蛾生物防治新技术提供参考。

参 考 文 献：

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