骨髓间充质干细胞对豚鼠皮肤光老化治疗作用的研究

[摘要]目的：探讨骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）皮肤光老化的修复作用，为皮肤光老化的治疗提供新的治疗途径。方法：UVA，UVB紫外线灯同时照射豚鼠，每天2h，连续照射50天，制备皮肤光老化模型；紫外线照射2周后，在豚鼠皮肤照射区，局部多点皮内注射DAPI标记的第3代豚鼠BMSCs 0.8ml（1×105个/ml），每周一次。注射后24h、5天及10天观察豚鼠皮肤变化，同时取照射区的皮肤制备冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察DAPI标记的BMSCs在紫外线照射区皮肤组织内的迁徙及定居情况。结果：与对照组相比，随照射时间的延长，未治疗组皮肤光老化症状逐渐加深，出现皱纹，皮肤松弛、修复性增厚，皮屑，色素沉积，皮革样外观；BMSCs治疗组在治疗前出现的症状与未治疗组相同，治疗后上述症状逐渐消失，未出现色素沉着。激光共聚焦显微镜下观察，注射后24h，BMSCs出现在真皮层；注射后5天BMSCs出现在真皮层以及毛囊等组织；注射后10天广泛弥散在皮肤各层，包括角质层。结论：BMSCs对皮肤光老化有明显的延缓及修复作用。

[关键词]皮肤光老化；骨髓间充质干细胞；激光共聚焦显微镜

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03

Research of bone marrow mesenchymal stem cells curing photoaging of guinea pig skin

YAO Chun-li,SU Guan-fang

(Department of Laser Cosmetics and Plastic Surgery ofthe 2rd Hospital of Jilin University, Jilin 130041, Changchun,China)

Abstract：ObjectiveTo research bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) curing photoaging of guinea pig skin to provide a new way of curing skin photoaging.MethodsIrradiated guinea pigs 2 hours per day for 50 days using UVA and UVB ultraviolet radiator to establish skin photoaging model.After 2 week radiation executed multiple intradermal injections of the third-generation BMSCs(0.8ml,1×105/ml) marked by DAPI into the ultraviolet radiation area of guinea pig skin every week.Observed the skin 24h,5d and 10d after injection,and maked frozen section from the ultraviolet radiation area of guinea pig skin.Observed migration and ecesis of the BMSCs marked by DAPI in ultraviolet radiation area of guinea pig skin by laser scanning confocal microscope.ResultsCompared with control group,skin photoaging symptoms of the no-treatment group increased with irraditive time,wrinkles, cutis laxa,scurf reparativethickening,pigment deposition and leather appearance appeard.The same symptom of the treatment group gradually dissappered and no pigment deposition appeard in the treatment group.Using laser scanning confocal microscope the BMSCs marked by DAPI were observed appearing in dermis 24h after the injection,appearing in dermis,hair follicle,etc,5d after the injection,becoming dispersedly distributed in the entire layers of the skin including stratum corneum 10d after the injection.ConclusionBMSCs could obviously delay and cure skin photoaging.

Key words: skin photoaging; bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);laser scanning confocal microscope

Ei-Domyati M等[1]研究发现，在日光保护部位，皮肤Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原只有到80岁以后才表现出减少，但在日光曝露部位10岁时已减少20%左右，到90岁时减少50%左右，而且曝露部位的胶原纤维结构在40岁后出现紊乱。而Fathke C[2]研究证实，损伤的皮肤是BMSCs的靶组织，BMSCs能够缩短I型和III型胶原的转录，BMSCs治疗皮肤创伤的作用比公认的CD45+细胞亚群的作用更大。但BMSCs用于治疗皮肤光老化未见报道。因此，本研究在皮肤光老化模型豚鼠紫外线照射区皮内局部注射DAPI标记的BMSCs，观察BMSCs细胞在光老化皮肤内迁徙、定居以及对光老化组织的修复作用，为皮肤光老化的预防和治疗提供理论依据和实验数据。

1材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：DMEM（ScienCell，美国），胎牛血清（Hyclone公司，美国），二甲基亚砜、DAPI（Sigma公司，美国）；倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本），15W UV-A和UV-B紫外灯（上海晨辰照明电器有限公司）。

1.2 实验动物与分组：健康雌性白色豚鼠，体重（220±20）g，30只，购自吉林大学医学院实验动物中心。皮肤光老化模型豚鼠20只，随机分为2组：未治疗组（单纯紫外线照射），治疗组（紫外线照射2周后，局部多点皮内注射0.8ml豚鼠BMSCs （1×105个/ml），每周一次）。另取正常豚鼠作为对照。BMSCs注射后24h、5天、10天，观察BMSCs对紫外线照射区皮肤的治疗作用。

1.3 皮肤光老化动物模型的建立：用剪毛剪剪除5cm×5cm区域的豚鼠背部毛，将15w UV-A和UV-B紫外灯并列置于豚鼠背部皮肤区正上方35cm处，每天照射2h，每天用剃须刀剔除新长出的豚鼠毛，观察豚鼠皮肤变化。

1.4 豚鼠BMSCs的体外分离培养：处死豚鼠乳鼠，75%酒精浸泡，无菌条件下取股骨和肱骨，用DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，用200目滤网过滤，制成单细胞。加入等体积的percoll分离液，1500r/min离心20min，吸取单个核细胞层加入DMEM培养液，1 200r/min离心8min，洗涤细胞，反复2次。计数，以(4±2)×106个/ml细胞接种于培养瓶中，加入含15%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中，每周换液2次。待细胞达80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代，传到3代备用。

1.5 DAPI标记的BMSCs对豚鼠皮肤光老化的治疗：称取DAPI 5.0mg，溶于1.427ml二甲基亚砜（DMSO）中，再加入713ml DMEM，混匀，作为DAPI应用液备用。收集培养第3代的豚鼠BMSCs，用DMEM洗涤2次，加入DAPI应用液10ml/瓶，置于37℃，5%CO2培养箱中，1h后，弃去DAPI应用液，用DMEM洗涤2次，加入含15％胎牛血清的DMEM，继续培养。24h后，荧光显微镜下观察细胞，确认标记成功后，收集细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml。紫外线照射2周后，在豚鼠皮肤照射区局部多点皮内注射0.8ml上述细胞。注射后24h、5天、10天观察照射区皮肤变化，并处死豚鼠，取紫外线照射区的皮肤制备冰冻切片，在激光共聚焦显微镜下观察DAPI标记的BMSCs的分布。

2结果

2.1 BMSCs对豚鼠皮肤光老化的治疗作用：在豚鼠紫外线照射区，局部多点皮内注射DAPI标记的第3代豚鼠BMSCs，肉眼观察可见，对照组皮肤无明显变化；与对照组相比，随照射时间的延长，未治疗组皮肤光老化症状逐渐加深，出现皱纹，皮肤松弛、修复性增厚，皮屑，色素沉积，皮革样外观（图1）；BMSCs治疗组在治疗前出现的症状与未治疗组相同，治疗后皱纹、皮肤松弛、修复性增厚、皮屑等症状逐渐消失，未出现色素沉着（图2）。

2.2 DAPI标记的BMSCs在紫外线照射区豚鼠皮肤组织内的迁徙和定居：将DAPI标记的BMSCs经皮肤紫外线照射区局部多点皮内注入后，取紫外线照射区的皮肤制备冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察，注射后24h，BMSCs出现在真皮层；注射后5天BMSCs出现在真皮层以及毛囊等组织；注射后10天广泛弥散在皮肤各层，包括角质层，如图3示。

3讨论

BMSCs具有：①来源相对广泛、取材方便；②低免疫源性，并可进行自体移植，大大降低了免疫排斥危险；③易于扩增（MSC可扩增达20代[3-4]）；④具有良好的可塑性，在损伤信号的诱导下能够分化为各种神经细胞；⑤具有对病变部位的“趋化性”等优点。因此被用于治疗皮肤损伤。大量研究结果表明，BMSCs在皮肤损伤中的应用都取得了理想效果，含有BMSCs 的组织工程皮肤移植后促进了烧伤创面的愈合[5]，复合BMSCs的组织工程真皮移植后，提高了愈合速度，获得了较理想的创面愈合效果[6]。但是应用BMSCs治疗皮肤光老化未见报道。皮肤光老化是皮肤衰老的一部分，对其预防与治疗，可以提高人们的生命质量。

因此，本研究模拟自然光线，建立豚鼠皮肤光老化模型，研究BMSCs对皮肤光老化的作用，以探索预防与治疗皮肤光老化的新途径。结果显示，与对照组相比，随照射时间的延长，未治疗组皮肤光老化症状逐渐加深，出现皱纹，皮肤松弛、修复性增厚，皮屑，色素沉积，皮革样外观；BMSCs治疗组在治疗前出现的症状与未治疗组相同，治疗后，皱纹、皮肤松弛、修复性增厚、皮屑等症状逐渐消失，未出现色素沉着。激光共聚焦显微镜下观察，注射后24h，BMSCs出现在真皮层；注射后5天BMSCs出现在真皮层以及毛囊等组织；注射后10天广泛弥散在皮肤各层，包括角质层。结果提示BMSCs延缓皮肤光老化，对皮肤光老化有修复作用。BMSCs对皮肤光老化治疗作用的机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Ei-Domyati M, Attia S, Saleh F, et al. Intrinsic aging vs.photoaging: a comparative histopathological, immnohisto-chemical, and ultrastructural study of skin[J]. Exp Dermtol,2002, 11(5) : 398-405.

[2]Fathke C,Wilson L,Hutter J,et al.Contribution of bone marrow derived cells to skin:collagen deposition and wound repair[J].Stem Cells,2004,22（5）:812-822.

[3]Rubio D, Garcia Castro J, Martin MC, et al. Spontaneous humanstem cell transformation[J]. Cancer Res,2005,65(8):3035-3039.

[4]袁 源,王媛丽,杨树源,等.人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究[J].青岛大学医学院学报,2006,42(2):120-122.

[5]刘 鹏, 邓志宏, 温 宁, 等. 复合骨髓间充质干细胞的组织工程皮肤修复烧伤创面的实验研究[J]. 中国美容医学,2007,16(4)：437-439.

[6]张兆清,余春艳,金 岩,等. 复合骨髓间充质干细胞的组织工程皮肤治疗慢性难愈性溃疡探讨[J]. 中国皮肤性病学杂志,2006, 20(4)：211-213.

[收稿日期]2008-01-09[修回日期]2008-03-15