BALB/c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法

【摘要】 目的 建立简便易行，存活好、产量和纯度高，稳定的枯否细胞(kupffer cell, kc)分离培养方法。方法 根据酶消化时间不同和裂解红细胞的方法在酶消化之后和之前分方法ⅰ和方法ⅱ。分别运用0.1%的ⅱ型胶原酶、0.05%链酶蛋白酶e和0.005%dnaseⅰ在不同方法中离体消化肝组织并进行密度梯度离心和贴壁培养提取kc，通过吞噬实验观察鉴定kc。结果 方法ⅰ和方法ⅱ中kc的数量分别是(0.71±0.21)×107/g和(0.96±0.20) ×107/g，细胞贴壁率分别40.1%、45.1%。用0.4%台盼蓝染色鉴定，存活率分别为90%、95%。吞噬实验发现，细胞纯度分别为90%、95%。结论 结合碾磨筛网滤过降低酶作用时间并在酶消化之前裂解红细胞分离提取枯否细胞具有存活好产量纯度高的优点。

【关键词】 枯否细胞;分离;鉴定;酶消化法

the isolation and culture of kupffer cell with different methods in balb/c mouse

liu jun gang, gao feng, zhang sen,et al.colorectal surgery, the first affiliated hospital of guangxi medical university, nanning 530021

[abstract] objective to establish a simple, activity and high?yield isolation method of kupffer cells (kc). methods two methods (ⅰandⅱ) were used by the times of enzymatic digestion and cracking red blood cells after or before. kc were isolated by 0.1%collagenaseⅱ,0.05% pronase e and 0.005% dnaseⅰdigestion of liver, density gradient centrifugation and adherent culture, identified by the phagocytosis of ink.results the number of kc by methodsⅰand ⅱ were (0.71±0.21) ×107/g and (0.96± 0.20) ×107/g, cell adhesion rates were 40.1%and 45.1%.identification by 0.4% trypan blue shows the cells survival rates were 90% and 95%.the cells purity were 90% and 95% in phagocytosis.conclusion combination of milling?screen filter to reduce the digestive time of enzyme and crack rbc before enzymes digestion is a good method for isolating kc.

[key words] kupffer cells; isolation; identification;enzyme digestion

肝脏是肿瘤转移的好发部位，又是巨大的免疫器官，含有丰富的免疫细胞?枯否细胞(kc)，它在多种因素所致的肝脏组织及继发变化起至关重要的作用。癌症的免疫治疗是目前研究的热点，能否通过激活肝脏的免疫活性达到预防和治疗肿瘤的目的，需要在体外实验分离kc并研究其活性。目前国内外存在多种分离培养kc的方法[1～4]，其中酶消化法的细胞产量、纯度及存活率还有待于提高。本实验对离体酶消化法不同过程分离培养kc方法做了比较，进一步完善了balb/c鼠分离培养枯否细胞的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性8～10周龄balb/c鼠，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供。合格证号：scxk桂2003?0003

1.2 主要试剂及配制 (1) 0.05%链霉蛋白酶e(roche产品)，d?hanks’液配制。(2) 0.1%ⅱ型胶原酶(gibco产品)，d?hanks’液配制。(3) 0.05%dnase i酶(sigma产品)，d?hanks’液配制, 调整ph=7.4。(4) percoll分离液(sigma产品)，取原液9份加1份无菌8.5%nacl (v/v)稀释得到100%percoll溶液，用时无菌生理盐水配成70%和30% (v/v)的浓度。(5) rpmi?1640培养液(gibco产品)，临用前加入10%新鲜灭活的胎牛血清(fcs)(杭州四季青公司产品)。 (6) 0.4%台盼蓝，40 mg台盼蓝粉剂溶于10 ml生理盐水中，分装备用。

1.3 主要仪器 (1)净化工作台sw?cj?if (苏州净化设备厂)。(2)heraeus培养箱(b5060 ek/co2 bet riebsanleitungoperatinginst ructions,德国)。(3)6孔、96孔一次性培养板(cornin品)。(4)台式低温冷冻离心沉淀机(sigma 3k15型)。(5)血细胞计数板。(6)200目的不锈钢筛网(cornin品)。

1.4 kc的分离培养方法比较

1.4.1 实验前准备 不锈钢盒装实验用品，包括剪刀两把、镊子两把、止血钳两把、小方纱6～10块;试剂制备和消毒(注意percoll分离液现用现配)。

1.4.2 离体酶消化法不同过程分离培养kc方法ⅰ和方法ⅱ 见表1。表1 分离培养kc方法注：加分离液和梯度离心液时注意保持离心管45°倾斜，梯度离心后可见液体分为5层， 从下至上分别70%percoll液、kc、30%percoll液、细胞碎片和rpmi?1640培养液。

1.4.3 kc的鉴定 在体外培养的孔板换液的时候，加入消毒过的含微量碳素颗粒的1640液，培养6 h后相差显微镜下观察，可见kc胞浆内吞噬了大量的碳素颗粒(见图1)。

2 结 果

2.1 kc的数量、纯度、存活率和贴壁率 见表2。

balb/c鼠质量为(25.56±1.72)g，肝质量为(1.22±0.26)g，肝脏和小鼠质量比为1∶18.49。用0.4% 台盼蓝染色和吞噬实验分别测定两种方法所得kc数量、存活率、纯度和贴壁率。表2 kc的数量、存活率、纯度和贴壁率

2.2 两种方法所得kc的形态比较 见表2。kc贴壁培养6 h后,与方法ⅰ相比，方法ⅱ所得kc折光性好，大部分已贴壁,呈扁圆形,少量细胞已开始伸突。

方法ⅰ方法ⅱ

图2 kc细胞贴壁6 h ×20倍

3 讨 论

肝脏是一个结构、功能复杂的实质性器官，由肝实质细胞和肝非实质性细胞组成，其中肝非实质性细胞占肝脏体积10%、细胞量的35%，主要是内皮细胞44%( v/v)、kc 33%(v/v)、贮脂细胞22%(v/v)[5]。kc系体内单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system，mps) 在肝内的成员，也是mps中定居于组织器官内最大的细胞群体，约占细胞总数的50%以上，在肝脏的防御及机体特异性免疫应答的诱导和调节中发挥了关键作用[6，7]，是机体细胞免疫的重要组成部分[8]，同时也是肠道屏障功能的组成部分[9]，kc在预防结直肠癌转移方面起到一定作用[3,10]。

但肝kc只占肝脏非实质细胞的33%，kc分离纯化比较困难。目前分离的方法有酶消化法、离心淘析法和机械分离法。离心淘洗能提高kc的纯度，去除细胞碎片和红细胞较多，但同时损失kc也较多，所以获得的kc的数量有限。机械分离法分离kc的同时也部分破坏kc细胞，获得的数量有限。酶消化法目前应用较多，有原位胶原酶灌注[11]、原位胶原酶/pronasee轮流灌注[12]和离体酶消化法[13]。本实验中发现balb/c鼠采用门静脉插管穿刺存在操作难度大且耗时容易污染，时间越长酶对细胞的活性影响就越大，实验结果就越不理想。我们在前人实验的基础上[13]选用了链酶蛋白酶e、ⅱ型胶原酶和dnase i，根据酶消化时间和裂解红细胞的顺序不同分了方法ⅰ和方法ⅱ，并对两种方法做了比较发现：(1) 方法ⅱ适当的运用了机械分离方法大大缩短了分离的时间，减少了酶对kc活性的损伤。与国内外同类方法相比[3,14]，本方法所使用的pronase e及其它的酶的量减少，消化时间也相应缩短，可获得较多数量的kc，且对kc 的活性影响较小。(2) 裂解红细胞的顺序不同也减少了酶的作用时间和酶对kc细胞的损伤。(3) 在贴壁培养的过程中发现方法ⅱ中获得细胞的活性和纯度比方法ⅰ都要好(见图2)，细胞生长速度快，细胞形态也有比较明显的改善。

本实验中我们依据文献[15]首选了对细胞无毒性、经济、耐高温高压、广泛用于各型肝组织细胞分离的percoll液，参考文献[16]并反复实验，确证在浓度为30%～70%梯度液的双层间可获得数量和纯度较满意的kc。在裂解红细胞过程中我们根据枯否细胞与红细胞对渗透压的耐受程度不同我们选用了三蒸水，减轻了对kc的损伤，同时也降低了实验的成本。方法ⅱ具有操作简便，酶的用量少，消化时间短，对kc损伤小所得kc活性好数量多等优点。

【参考文献】

[1]王永堂, 李关荣, 李春穴,等. lps 对小鼠枯否细胞核因子?кb 活性的促进效应[j]. 西南农业大学学报, 2001, 23(4) 325?328.

[2]edmiston kh, shoji y, mizoi t, et al. role of nitric oxide and superoxide anion in elimination of low metastatic human colorectal carcinomas by unstimulated hepatic sinusoidal endothelial cells. cancer res[j], 1998, 58(7): 1524?1531.

[3]ten hagen t, van vianen w, bakker?woudenberg i. isolation and characterization of murine kupffer cells and splenic macrophages[j]. j immunol methods, 1996, 193(1): 81?91.

[4]pulford k, souhami r. cell division and giant cell formation in kupffer cell cultures[j]. clin exp immunol, 1980, 42(1): 67?76.

[5]blouin a, bolender rp, weibel er. distribution of organelles and membranes between hepatocytes and nonhepatocytes in the rat liver parenchyma. a stereological study[j]. j cell biol, 1977, 72(2): 441?455.

[6]roberts ra, ganey pe, ju c, et al. role of the kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis[j]. toxicol sci, 2007, 96(1):2?15.

[7]hildebrand f, hubbard wj, choudhry ma, et al. kupffer cells and their mediators: the culprits in producing distant organ damage after trauma?hemorrhage. am j pathol, 2006, 169(3): 784?794.

[8]tu z, bozorgzadeh a, pierce rh, et al. tlr?dependent cross talk between human kupffer cells and nk cells[j]. j exp med, 2008, 205(1): 233?244.

[9]sanchez perez mj,gonzalez?reimers e, santolapia?fernandez f, et al. lipid peroxidation and serum cytokines in acute acute alcoholic hepatitis[j]. alcohol alcohol, 2006, 41(6): 593?597.

[10]miyagawa s, miwa s, soeda j, et al. morphometric analysis of liver macrophages in patients with colorectal liver metastasis[j]. clin exp metastasis, 2002, 19(2):119?125.

[11]chen gg, lai pb, hu x, et al. negative correlation between the ratio of bax to bcl?2 and the size of tumor treated by culture supernatants from kupffer cells[j]. clin exp metastasis, 2002, 19(5): 457?64.

[12]van der bij g, oosterling s, meijer s, et al. therapeutic potential of kupffer cells in prevention of liver metastases outgrowth[j]. immunobiology, 2005, 210(2?4): 259?265.

[13]张森, 万德森, 肖锡宾. balb/c 鼠枯否细胞的分离培养与鉴定[j]. 大肠病外科杂志, 2003, 9(2): 88?92.

[14]张馨, 余卫平, 高蕾,等. 内毒素刺激的kupffer细胞对肝星状细胞增殖的影响. 江苏医药, 2003, 29(12): 896?898.

[15]smedsrod b, pertoft h. preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of percoll centrifugation and selective adherence[j]. j leukoc biol, 1985, 38(2): 213?230.

[16]ikejima k, enomoto n, seabra v, et al. pronase destroys the lipopolysaccharide receptor cd14 on kupffer cells[j]. am j physiol gastrointest liver physiol, 1999, 276(3): g591?598.