当归对阴虚哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影响及机制研究

[摘要] 当归是临床常用中药，具有补阴养血、活血润燥的功能。为研究当归对阴虚哮喘Balb/c小鼠Th1/Th2及Th17/Treg的影响及机制，该实验通过卵清白蛋白加甲状腺素复制阴虚哮喘Balb/c小鼠模型，造模同时分别给予地塞米松（DXM）、当归提取液、当归提取液+DXM灌胃处理，HE染色进行肺组织病理学检查，ELISA法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平及维甲酸受体相关孤儿受体（RORγt）的表达情况。结果显示，当归可显著减轻肺组织炎症浸润程度，升高IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值，降低肺组织中RORγt的表达强度，当归与DXM配伍的治疗效果最为显著。提示，当归可通过抑制肺组织RORγt表达、调节Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，改善气道的炎症状态，发挥对阴虚型哮喘的治疗作用。

[关键词] 当归；阴虚哮喘；Balb/c小鼠；Th1/Th2；Th17/Treg

[Abstract] Angelicae Sinensis Radix， with nourishing Yin， promoting blood circulation， and moisturizing dryness functions， is commonly used in clinical medicine. In order to investigate the effects and mechanism of Angelica sinensis（AS） on Th1/Th2 and Th17/Treg in mice with asthma and Yin deficiency syndrome， asthmatic and Yin deficiency syndrome Balb/c mice models were established by injecting and inhaling ovalbumin（OVA） and thyroxin. The models were treated with dexamethasone（DXM）， AS extract and AS extract+DXM， respectively. Pathological examination of lung tissues was conducted by HE staining， and ELISA was used to detect the levels of IL-4， IL-17， IFN-γ， TGF-β as well as retinoic acid receptor-related orphan receptor （RORγt）. Results showed that AS could significantly improve the situation of inflammation infiltration， increase ratios of IFN-γ/IL-4 and TGF-β/IL-17， decrease the levels of RORγt in lung tissues. The AS+DXM group showed a best treatment effect. The results indicated that AS played a therapeutic role for asthma with Yin deficiency syndrome and improved airway inflammation by inhibiting the expression of RORγt in lung tissues and regulating the balance of Th1/Th2 and Th17/Treg.

[Key words] Angelicae Sinensis Radix； asthma with Yin deficiency syndrome； Balb/c mouse； Th1/Th2； Th17/Treg

哮喘（asthma）是我临床中常见的一种呼吸系统疾病，其临床发作具有周期性、反复性、迁延不愈的特点[1-2]。2013年哮喘流行病学调查数据显示，我国大陆地区哮喘总患病率高达1.24%，严重威胁公众健康[3]。研究表明，哮喘发病的主要病理学机制是辅T细胞（Th）亚群的免疫功能失调，其中，Th1/Th2与Th17/调节性T细胞（Treg）的功能平衡是影响呼吸道炎性因子分泌及促炎症反应的关键因素[4-5]。近年来，中药以其多途径、多靶点调节机体免疫功能的特点在临床哮喘的治疗中取得优势。当归（Angelica sinensis，AS）为补血养阴活血的常用中药之一，《本草经疏》记载当归有“主咳逆上气”之功效[6]，以往实验研究报道当归挥发油对支气管平滑肌有明显的解痉作用[7]。然而，当归对机体T细胞亚群的免疫调节机制目前尚未完全明确。本研究通过复制阴虚哮喘Balb/c小鼠模型，研究当归对Th1/Th2及Th17/Treg细胞因子的影响，探讨当归治疗哮喘的免疫调节机制，为当归用于临床哮喘的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物与试剂 50只雌性Balb/c小鼠，周龄（7.2±0.8）周，体重（20.15±1.62） g，供应单位为北京中医药大学，合格证0014036，许可证号SCXK（京）2016-0024。当归提取液由上海和黄药业有限公司生产（国药准字Z31020419）。致敏试剂卵清白蛋白（OVA）购自美国Grade V Sigma公司（批号101069301）。甲状腺片购自山东中泰药业有限公司（国药准字H37021712，批号14080303），地塞米松磷酸钠注射液（DXM）由河南科伦药业有限公司提供（国药准字H41023598，批号13011911），ELISA细胞因子试剂盒购自R&D systems（美国），免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司（批号AD082522）。

1.2 动物模型制备 50只Balb/c小鼠根据随机数字表法平均分为5组，每组10只，分别为空白对照组、阴虚哮喘组、地塞米松组、当归组及当归+地塞米松组。实验开始时，使用溶质为OVA 1 mg和氢氧化铝凝胶100 mg的生理盐水混悬液制备哮喘致敏液，除对照组外，所有小鼠均给予2次致敏液1 mL腹腔注射行全身致敏处理，注射时间间隔为1周（1 d，8 d）。全身致敏1周后（15 d）起，所有小鼠雾化吸入1%OVA行呼吸道致敏，隔日致敏1次，对照组不进行致敏处理，采用生理盐水代替致敏药物行腹腔注射及雾化吸入。给予DXM组、当归组及当归+DXM组小鼠DXM（0.5 mg・kg-1）、当归提取液（4 g・kg-1）、当归提取液+DXM（4 g・kg-1+0.5 mg・kg-1）灌胃处理，对照组及阴虚哮喘组以20 mL・kg-1生理盐水灌胃处理，雾化激发及药液灌胃均连续28 d。实验第29天开始，各组小鼠药液灌胃后8 h给予甲状腺素120 mg・kg-1（采用0.5%黄原胶助悬）灌胃处理制备阴虚模型，1次/d，连续14 d，对照组给予0.5%黄原胶对照液灌胃处理[8-9]。

1.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）的收集 实验第43天，将小鼠麻醉处理后气管插管，结扎左支气管，使用生理盐水反复灌洗右侧支气管肺泡并记录每次灌洗液回收量，3次灌洗液回收率均大于80%，提取各组BALF约2.5 mL/鼠离心处理（2 000 r・min-1，10 min），将上清液储存备用，储存温度为-80 ℃。

1.4 细胞因子检测 所有BALF上清液收集完毕后，于4 ℃条件下解冻，根据ELISA试剂盒说明书的操作方法，分别检测各组Balb/c小鼠致敏前后及剂处理前后细胞因子IL-4，IL-17，IFN-γ，TGF-β水平。取所有灌洗液沉淀涂片，瑞士染色后采用血细胞计数板进行炎性细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞分类计数。

1.5 肺组织病理学改变及免疫组化检测 将未经灌洗的左肺组织制作石蜡切片，根据免疫组化试剂盒说明进行染色后，在高倍镜下观察肺组织病理学改变及维甲酸受体相关孤儿受体（RORγt）的表达情况，对肺组织炎性细胞浸润程度进行半定量检测。

1.6 统计学分析 将整理后的所有检测数据录入SPSS 19.0软件，计数资料采用±s表示，组间数据检验采用单因素方差分析，等级资料比较采用Ridit分析，P

2 结果

2.1 各组小鼠BALF沉淀中炎性细胞计数的比较 采用甲状腺素及OVA致敏后，阴虚哮喘组小鼠BALF沉淀中炎性细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞较对照组均显著升高（P

2.2 各组小鼠肺组织病理学改变的比较 镜下观察发现，对照组小鼠肺组织病理变化不明显，模型组小鼠肺组织出现明显的病理变化：气道上皮细胞肿胀、部分脱落，基底膜较厚，支气管壁充血、结构模糊。经DXM和当归干预后，上述肺组织病理学变化得到不同程度的缓解。对肺组织炎性细胞浸润情况进行半定量分析结果显示，当归+DXM组与阴虚哮喘组比较，差异有统计学意义（P

2.3 各组小鼠BALF中细胞因子水平的比较 对各组小鼠BALF中促炎因子IL-4，IL-17及炎症抑制因子IFN-γ，TGF-β的水平进行检测，数据显示，采用OVA及甲状腺素致敏处理后，小鼠BALF中促炎因子水平均显著高于对照组且炎症抑制因子水平明显下降（P

2.4 各组小鼠BALF中IFN-γ/IL-4，TGF-β/IL-17的比较 经OVA及甲状腺素致敏处理后，阴虚哮喘组小鼠IFN-γ/IL-4与TGF-β/IL-17的比值较对照组

出现显著降低（P

2.5 各组小鼠肺组织中RORγt表达的比较 检测小鼠肺组织中RORγt的表达，发现阴虚哮喘组小鼠肺组织中RORγt的表达强度最高（P

3 讨论

哮喘又称为支气管哮喘，是一种以气道慢性炎症、黏液高分泌及气道重塑为主要病理生理特征的慢性呼吸系统疾病[10-11]。近年来，我国哮喘的发病率呈持续上升趋势[12]，发病时，患者由于嗜酸性粒细胞及多种炎性细胞浸润气道引起的过敏反应及气道高反应性而出现一系列喘息、胸闷等可逆性呼吸气流限制症状，严重者可导致急性呼吸衰竭，严重影响患者的生活质量及身体健康[13]。

Th1/Th2功能失调是目前被普遍认同的哮喘发病的核心免疫机制[14]，Th2型免疫反应增强而Th1型免疫反应减弱，IL-4的高表达降低了炎症抑制因子IFN-γ的活性，使患者血IgE浓度增加及气道嗜酸性粒细胞聚集，导致支气管平滑肌痉挛及气道通气功能下降[15-16]。近期研究中发现[17]，除Th1与Th2之外，Th17与Treg在正常机体中相互制约而处于平衡状态，当机体受到致敏原刺激处于超敏反应状态时，Th17与Treg的功能平衡被打破，Th17的特征性细胞因子IL-17分泌增多，导致大量炎性细胞尤其是中性粒细胞趋化聚集于气道，进一步促进并加重气道的促炎症反应 [18-19]。Treg细胞通过分泌TNF-β抑制嗜酸性粒细胞的活化，减少Th2细胞促炎症因子的分泌从而缓解气道炎症，抑制哮喘反应的发生[17，20]。

当归是临床常用的中药，具有补阴养血、活血润燥的功能，临床广泛应用于包括呼吸系统在内的各种疾病。祖国医学认为，当归味甘而重，故专能补血养阴，其气轻而辛，故又能行血，补中有动，行中有补，为阴分血中之要药。现代药理研究证实，当归对痉挛的支气管平滑肌具有明显的解痉作用[7]。

本实验采用OVA与甲状腺素复制阴虚哮喘小鼠模型，致敏后，阴虚哮喘组小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值显著降低，出现明显的Th1/Th2及Th17/Treg功能失调。当归治疗后，BALF中IFN-γ/IL-4及TGF-β/IL-17的比值较阴虚哮喘组明显回升，其中，当归+DXM小鼠BALF中细胞因子表达水平明显优于DXM组及当归组，提示当归与DXM配伍可表现出良好的协同作用，通过改变Th1/Th2及Th17/Treg的功能平衡，提高激素对阴虚哮喘的疗效，实现平喘作用。

哮喘的发病与演变是多种炎性细胞共同参与的结果，以往研究报道，嗜酸性粒细胞浸润引起的气道过敏反应造成气道的高反应状态，而气道内中性粒细胞集聚增多可作为哮喘急性加重的标志[21-22]。本实验结果显示，当归组小鼠BALF中炎性细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞较阴虚哮喘组明显降低，当归+DXM小鼠BALF中嗜酸性粒细胞明显低于DXM组，表明当归有助于缓解气道炎性细胞的浸润，改善气道炎症及超敏状态。

转录因子RORγt在哮喘的免疫致敏过程中可促进Th17的分化与激活并发挥与IL-17的协同作用[17，23]。本实验对小鼠肺组织中RORγ进行检测发现，阴虚哮喘小鼠肺组织中RORγt的表达明显增强，当归处理后肺组织中RORγt的表达强度明显降低，当归+DXM组小鼠RORγt的表达明显低于DXM组，提示当归可通过抑制肺组织中RORγt的高表达，降低Th17细胞活性，平衡Th17/Treg功能，成为当归改善气道炎症反应的机制之一。

综上，当归可通过抑制肺组织RORγt的高表达、调节Th1/Th2及Th17/Treg的免疫功能平衡，缓解气道的炎症状态，提高气道通气功能并最终改善哮喘，为临床哮喘的辅助用药方案提供了新思路。

[参考文献]

[1] Izuhara K， Ohta S， Shiraishi H， et al. The mechanism of mucus production in bronchial asthma [J]. Curr Med Chem， 2009， 16（22）： 2867.

[2] 伟斌， 黄勋， 姚敏.辛苍汤鼻腔灌洗对哮喘儿童缓解期细胞因子的调控作用[J].浙江中医药大学学报， 2013， 37（3）：272.

[3] 王嵩， S庆.中药对小鼠哮喘模型T细胞免疫调节的研究[J].中国免疫学杂志， 2014， 24（11）：1578.

[4] 龚臣， 邓静敏.Th17/Treg在支气管哮喘发病机制中的作用及研究进展[J].中华哮喘杂志（电子版）， 2013， 7（3）：201.

[5] Pelaia G， Vatrella A， Maselli R. The potential of biologics for the treatment of asthma[J]. Nat Rev Drug Discov， 2012， 11（12）： 958.

[6] 王志旺， 蔺兴遥， 任远，等.当归精油对哮喘模型大鼠的平喘作用及其对IL-10、IL-17A的影响[J].中药药理与临床， 2015， 31（3）：76.

[7] 吴国泰， 任远， 王锋， 等.当归挥发油不同部位对豚鼠离体气管平滑肌的作用及机制研究[J].甘肃中医学院学报， 2011， 28（4）：1.

[8] 王志旺， 妥海燕， 任远， 等.BALB/c小鼠阴虚型过敏性哮喘模型的建立与评价[J].中国中医药信息杂志， 2016， 23（9）：61.

[9] 贺玉伟， 柴程芝， 寇俊萍， 等.甲状腺素诱导小鼠模型表观指征变化与阴虚火旺证的相关性研究[J].实验动物科学， 2013， 30（2）：1.

[10] 王志旺， 妥海燕， 任远，等.当归对阴虚哮喘小鼠模型Th17优势免疫应答的影响[J]. 免疫学杂志， 2016（1）：38.

[11] 陈旭央， 张冰， 胡莉蔓.IL-17、IL-33在哮喘发病机制中的作用[J].中国医药导报， 2015（16）：29.

[12] 张春霞， 陈柏谕.IL-33与儿童常见自身免疫性疾病关系的研究进展[J].临床儿科杂志， 2014， 32（5）：491.

[13] 韩文宁， 李锦亮.咳嗽变异性哮喘患者白细胞介素-4， 5及IgE水平的变化[J].中国生育健康杂志， 2013， 24（2）： 615.

[14] Borish L， Steinke J W. Interleukin-33 in asthma： how big of a role does it play？ [J]. Curr All Asthma Rep， 2011， 11（1）： 7.

[15] Liew F Y， Pitman N I， McInnes I B. Disease-associated functions of IL-33： the new kid in the IL-1 family [J]. Nat Rev Immunol， 2010， 10（2）： 103.

[16] Lloyd C M. IL-33 family members and asthma-bridging innate and adaptive immune responses[J]. Curr Opin Immunol， 2010， 22（6）： 800.

[17] 李燕， 谢敏， 史小玲，等. HSP70/C D80 DNA疫苗通过调节Th1/Th2/Treg/Th17细胞对小鼠急性哮喘的抑制作用[J]. 山东大学学报：医学版， 2014， 52（10）：20.

[18] 赵燕， 程晓明， 王长征，等.Th17应答在哮喘发病机制中作用的研究进展[J].重庆医学， 2013， 42（2）：216.

[19] Smith D E. IL-33： a tissue derived cytokine pathway involved in allergic inflammation and asthma [J]. Clin Experiment All， 2010， 40（2）： 200.

[20] Ji N F， Xie Y C， Zhang M S， et al. Ligustrazine corrects Th1/Th2 and Treg/Th17 imbalance in a mouse asthma model [J]. Int Immunopharmacol， 2014， 21（1）： 76.

[21] 龚臣，邓静敏.Th17/Treg 在支气管哮喘发病机制中的作用及研究进展[J].国际呼吸杂志，2013，33（9）：684.

[22] Dahia P L， Aguiar R C， Alberta J， et al. PTEN is inversely correlated with the cell survival factor Akt/PKB and is inactivated via multiple mechanismsin haematological malignancies[J]. Hum Mol Genet， 1999， 8（2）： 185.

[23] 马佳佳， Nick Lu， 陈必良. 转录因子RORγt对妊娠期哮喘模型小鼠 Th17/Treg平衡的调节作用[J]. 医学杂志， 2012， 37（6）： 561.