尿酸钠作为佐剂对BALB/c小鼠体液免疫应答的影响

【摘 要】目的：探讨尿酸钠作为佐剂对BALB/c小鼠体液免疫应答的影响及机制。方法：利用弗氏佐剂和尿酸钠悬浮液为佐剂、天花粉蛋白（TCS）为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫，以酶联免疫测定法检测特异性抗体IgG的效价。结果：传统弗氏佐剂可极大地增强TCS对小鼠的血清IgG效价，而尿酸钠对IgG效价不但没有促进，反而有明显的抑制作用。提示尿酸钠佐剂对抗体应答不但没有促进，与单独使用免疫原相比，抗体应答反而明显降低。结论： 与弗氏佐剂相比，尿酸钠悬浮液作为佐剂，对体液免疫应答有一定的抑制作用。

【关键词】尿酸钠；；弗氏佐剂；体液免疫应答；天花粉蛋白；酶联免疫吸附测定

明矾在一定pH条件下产生氢氧化铝胶体吸附抗原而产生佐剂效应。明矾佐剂一般用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽肿和脓肿，其机理未知，近期报告明矾佐剂通过诱导产生尿酸而起作用。本文研究尿酸钠作为佐剂对蛋白质性抗原天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）免疫小鼠时诱发的特异性抗体应答的影响，从而了解尿酸钠对体液免疫应答的影响。

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是中草药天花粉的有效成分， 存在于栝楼的块根中。天花粉作为中草药，14世纪主要用于妇科疾病的治疗。70年代，中科院上海细胞所提取出有效的活性成分-TCS。此后，药理学的研究发现，它是一类核糖体抑制蛋白，并有抑制免疫反应的作用，而且可以抑制HIV病毒在其感染的淋巴细胞和单核细胞中的复制，制止HIV病毒在患者体内的扩散，90年代初，曾将TCS试用于艾滋病的一期和二期临床治疗，但由于天花粉蛋白的强过敏原性，对艾滋病患者的肝脏损伤很大，并引起了高烧、虚弱、炎症等一系列副作用，因而停止实验。但作为抗肿瘤药物的研究一直在进行。

本研究中，以TCS作为抗原，与尿酸钠、完全弗氏佐剂一起免疫小鼠，评价尿酸钠对抗体应答（即体液免疫应答）的影响。选择TCS作为抗原的理由是该蛋白免疫原性强，单独免疫即可诱发较强的特异性抗体应答，从而便于评价佐剂的效应。

一、实验材料

（一）实验动物

6～8 周龄、SPF级雌性BALB/c小鼠， 体重19～22g， 购于南方医科大学实验动物中心。

（二）主要试剂和仪器

弗氏完全佐剂，明矾， 尿酸钠（uric acid sodium salt， UANa），邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD），PBS-T（phosphate buffered saline-tween 20）等购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（horseradish peroxidase-gimmunoglobulin G，HRP-IgG），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）RPMI-1640/DMEM干粉 等购自美国Invitrogen/Gibco公司；天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）上海金山制药厂生产；低温离心机：Megafuge 1.0R型，德国Herculeus公司；酶标仪：680型，美国Bio-Rad公司 ；96 孔聚苯乙烯酶标板，丹麦Nunc 公司；自动酶标仪美国Hyperion 公司。

二、实验方法

（一）免疫佐剂的制备

尿酸钠悬浮液的制备，称取尿酸钠晶体，研磨为粉末后悬于生理盐水，加热搅拌，直到形成均质悬浮液，终浓度为2.5 μg/μL灭菌备用。采用注射器双推的方法，在注射器内反复双推，充分将弗氏完全佐剂与天花粉蛋白混合直至形成均质的乳浊液，用以免疫小鼠制备抗体。

（二）鼠的免疫和抗血清的制备

BALB/c小鼠随机分为以下3组（每组5只）：（1）弗氏完全佐剂组（10 μg TCS+ 100μL CFA）；（2）尿酸钠佐剂组（10 μg TCS+200 μg UANa）；（3）生理盐水对照组（10 μg TCS）。抗原和佐剂充分混合，免疫途径为背部皮下多点注射，每点50 μL共200 μL注射，初次免疫2 w之后以相同的剂量和途径进行加强免疫，10 d后剪尾取血约200 μL血样于37 ℃静置1 h，4 ℃过夜，第二天3000 r/min离心30 min，取上清即为免疫抗血清，-20 ℃保存备用。

按常规ELISA的方法测定抗血清的效价。参照文献[4]，方法简述如下：96孔板以每孔100 μL抗原TCS（5 μg/mL）于4 ℃包被过夜，PBS-T洗后，每孔加入含有5 %脱脂奶粉的PBS-T（phosphate buffered saline-tween 20）封闭液200 μL，37 ℃湿盒温育1 h。PBS-T洗后，各孔分别加入100 μL按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200稀释的抗血清，阴性对照血清（同批NaCl免疫的小鼠血清）稀释方法相同，37 ℃湿盒温育1 h，用PBS-T洗后，每孔加入1：4000稀释的HRP-IgG，100 μL，37 ℃湿盒温育1 h，洗后每孔加入OPD显色液显色，加入终止液 2 mol/L H2SO4，Bio-Rad 680型酶标仪测定490 nm光吸收值。结果判定以（OD值-空白对照） / （阴性对照-空白对照） 大于2为阳性，小于1.5为阴性，介于2和1.5之间为可疑。

（三）统计学处理

结果以均数±标准差（x ± s ） 表示，数据以非配对t检验进行分析，以P

三、结果

以弗氏完全佐剂免疫小鼠的抗血清为阳性对照，检测尿酸钠对小鼠体液免疫应答的影响，结果见图 1和表 1。与单独以TCS免疫诱导的特异性抗体水平相比，尿酸钠为佐剂组TCS诱导的IgG效价明显降低（* P

四、讨论

为了探讨尿酸钠对体液免疫应答的影响，以天花粉蛋白（TCS）为免疫原，在小鼠体液免疫实验中分析了尿酸钠佐剂对特异性抗体应答的作用。研究结果显示，弗氏佐剂能极大地增强TCS特异性抗体应答，而尿酸钠对血清IgG的效价不但没有促进，反而有明显的抑制作用。这一结果提示，尿酸钠对体液免疫作用是抑制性的，但其中的原因尚不清楚。

实验结果表明，尿酸钠不能增强Th2型免疫反应。有研究表明，若同时在实验动物体内注射尿酸和抗原物质时，可诱导出强烈的CD8+ T细胞免疫反应，说明尿酸钠对Th1型免疫应答有促进作用。体外实验发现，尿酸能促进了DC分泌IL-12p70，促进IL-12p70 mRNA的表达。IL-12是DC分泌的重要免疫调节分子，可特异性促进Th1细胞分化而抑制Th2细胞分化，从而诱导特异的Th1细胞免疫应答。这些研究与我们的结果一致，并在一定程度上解释了尿酸钠抑制TCS诱发的抗体应答的原因。

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基金项目：本文系韶关市科技局卫生局免疫学教学、D-二聚体的部分研究成果，课题编号：2013Y13100。

作者简介：刘春永（1986- ），男，河南洛阳人，硕士，讲师，研究方向：免疫调节和免疫药理。