HPLC测定药用芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素含量

摘要：目的 以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐（[BMIM]Br）为萃取剂超声辅助萃取，高效液相色谱法同时分离测定芦荟中的芦荟苷和芦荟大黄素。方法 采用Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-0.3%冰醋酸水溶液（65∶35）；流速：0.80 mL/min；紫外检测波长：360 nm；柱温：35 ℃。结果 芦荟苷和芦荟大黄素分别在0.000 336～1.68 ?g（r=0.999 96）、0.000 608～3.04 ?g（r=0.999 76）范围内线性关系良好，检出限分别为0.050 6、0.262 ng/mL，平均加样回收率分别为95.99%、95.80%。结论 本法操作简单快速、定量准确、灵敏度高、成本低，且对环境友好，是检测及分离芦荟中蒽醌类化合物的有效方法。

关键词：离子液体；超声辅助；高效液相色谱法；芦荟；芦荟苷；芦荟大黄素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.022

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0059-03

芦荟系百合科芦荟属多年生肉质草本植物，具有清肝热、通便的作用，用于便秘、小儿疳积、惊风，外治湿癣。现代研究发现，芦荟除具有抗炎、抗辐射等功效外，还具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节血糖等多种药理作用。芦荟的主要药用成分是以芦荟苷、芦荟大黄素为主的蒽醌类衍物，因此，对这2种有效成分的测定具有极其重要的意义。目前虽已有芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素相关的测定研究报道，但其前处理多采用以甲醇和乙醇为主的有机溶剂回流提取法[1-5]，不仅消耗时间长，且易污染环境。本试验以离子液体1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐（[BMIM]Br）溶液为萃取剂，利用超声辅助萃取，为芦荟资源的综合开发利用提供质控依据。

1 仪器与试药

LC-20AT液相色谱输液泵，SPD-20A紫外检测器，CTO- 10AS柱温箱，LC-Solution色谱数据处理系统（日本岛津公司）；KH-3200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；

TGL-16 g高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；SZ-2自动双重纯化水蒸馏器（上海泸西分析仪器）；FA2004A型分析天平。

芦荟苷、芦荟大黄素、对照品（纯度均≥98.5%，上海晶纯实业有限公司），1-丁基-3-甲基咪唑溴化盐（纯度≥99%，中科院兰州化学物理研究所），甲醇（分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂），乙醇（分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂），冰醋酸（分析纯，重庆川东化工有限公司化学试剂厂），二次蒸馏水（实验室自制）。芦荟原材料（产地广东，批号20120313）购于当地药房，经西南大学黄承志教授鉴定为百合科植物芦荟叶的汁液干燥浓缩物。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 ?m）。流动相：甲醇-0.3%醋酸（65∶35）；流速：0.8 mL/min；进样量：20 ?L；检测波长：360 nm；柱温：35 ℃。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品芦荟苷、芦荟大黄素适量，甲醇溶解，配制成芦荟苷420 ?g/mL、芦荟大黄素760 ?g/mL的溶液，作

为储备液，避光保存，待用。分别准确吸取2种对照品储备液适量，用流动相配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，置于冰箱（4 ℃）内避光保存备用。

2.3 供试品溶液的制备

将芦荟原材料于70 ℃干燥至恒重后粉碎，过60目筛（0.5～1.2 mm），干燥条件下保存备用。准确称取0.1 g芦荟粉末，加入5 mL 1.2 mol/L离子液体溶液，浸泡4 h，超声（150 W， 40 kHz）萃取30 min，过滤取滤液，3500 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 ?m有机滤膜过滤，进样分析。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，用甲醇稀释至不同浓度。其中芦荟苷浓度分别为0.016 8、0.168、1.68、8.40、42.00、84.00 ?g/mL，芦荟大黄素浓度分别为0.030 4、0.304、3.04、15.20、76.00、152.00 ?g/mL。从低浓度到高浓度，依次进样，每个浓度进样3次，每次20 ?L，按“2.1”项下色谱条件进行高效液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：芦荟苷Y=19 964.74+56219.89X，r=0.999 96，其线性范围为0.000 336～1.68 ?g，检出限为0.050 6 ng/mL；芦荟大黄素Y=12 222.17+11 735.99X， r=0.999 76，其线性范围为0.000 608～3.04 ?g，检出限为0.262 0 ng/mL。

2.5 精密度试验

精密吸取芦荟苷、芦荟大黄素浓度分别为42、76 ?g/mL的对照品混合液20 ?L，按“2.1”项下色谱条件进样分析，重复进样6次，测定各对照品的峰面积，结果芦荟苷峰面积RSD=1.03%，芦荟大黄素峰面积RSD=3.21%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下供试品溶液20 ?L，在避光条件下，于0、4、8、12、16、20、24、48 h分别进样，测定芦荟苷的峰面积RSD=2.21%，芦荟大黄素峰面积RSD=0.68%，表明该方法稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一批芦荟样品6份，按“2.3”项下方法制备，“2.1”项下色谱条件测定。结果芦荟苷峰面积RSD=4.62%，芦荟大黄素峰面积RSD=3.82%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批芦荟样品0.1 g 6份，分成3组，每组按照低、中、高3个标准准确加入对照品混合液，按“2.3”项下方法制备，“2.1”项下色谱条件测定。芦荟苷、芦荟大黄素的回收率测定结果见表1。

2.9 样品含量测定

取同一批次芦荟样品6份，每份0.1 g，按“2.3”项下方法制备，“2.1”项下色谱条件测定，其样品含量测定结果见表2。

3 讨论

本试验比较了CH3OH-H2O、CH3OH-CH3COOH体系对2种目标分析物的分离效果。当流动相为CH3OH-H2O体系时，调节流动相比例组分峰可以分离，但峰形较宽。当流动相为CH3OH-CH3COOH时，不断调节其比例时，发现甲醇比例65%时，2组分能在合适时间内出峰。在色谱柱允许的pH范围内，考察了醋酸比例对峰形的影响，当醋酸比例为0.3%（V/V）时，峰形最佳，故最终选择CH3OH-0.3%CH3COOH体系为流动相。

本试验分别采用甲醇、乙醇和[BMIM]Br以及TritonX-100溶液为提取剂，比较了它们对目标分析物的提取效果，结果表明，当以离子液体[BMIM]Br溶液作为提取剂时，芦荟苷和芦荟大黄素的提取率明显提高。本试验还比较了不同浓度的离子液体对提取率的影响，结果表明，当用1.2 mol/L离子液体时，提取率最高，当离子液体浓度过高时离子液体的黏度很大，对色谱柱子的影响较大。故最终选择离子液体的浓度为1.2 mol/L。为了得到最佳的提取效果，本试验还考察了不同的固液比对萃取率的影响。当固液比分别为1∶20、1∶30、1∶50、1∶80、1∶100 g/mL时，2种目标分析物的提取率刚开始时显著增加，但当固液比增至1∶100 g/mL时，提取率没有明显增加，因此，本试验以1∶80 g/mL为最佳固液比。

样品含量测定结果表明，芦荟中芦荟苷含量极高，而芦荟大黄素含量相对较少，因此，对该药的正确定量使用具有一定的参考价值。本试验采用离子液体提取芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素，得到了较好的提取效果。离子液体，又称室温离子液体，一般由结构不对称的有机阳离子和无机阴离子组成，是在室温或接近室温下呈液态的有机盐[6]，具有不挥发、液程宽、溶解强和可设计调节等特性[7-8]。使用离子液体作为提取剂，该方法操作简单、快捷、绿色环保，定量结果可靠，回收率较高，适合用于芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素的检测，从而为芦荟中芦荟苷和芦荟大黄素的检测提供了一种新的方法。

参考文献：

[1] 陈伟，林新华，黄丽英，等.芦荟甙和芦荟大黄素的提取和同时测定[J].福建分析测试，2002，11（1）：1512-1514.

[2] 王书杰，肖金鱼，王秀花.不同品种芦荟中芦荟苷的含量测定[J].药物研究，2011，20（16）：24-25.

[3] 刘玉魁，郭迎霞，赵作连，等.药用芦荟中芦荟苷的提取分离及含量测定[J].医药导报，2007，26（4）：413-414.

[4] 高钧，毕开顺，王玺，等.高效液相色谱法测定芦荟中芦荟苷的含量[J].药物分析杂志，2001，21（6）：387-389.

[5] 付银龙，钱和.芦荟苷的提取与检测[J].江苏食品与发酵，2002，9（2）：24-27.

[6] 李汝雄.绿色溶剂――离子液体的合成与应用[M].北京：化学工业出版社，2004：10-20.

[7] 张锁江，吕兴梅.离子液体――从基础研究到工业应用[M].北京：科学出版社，2006：265.

[8] 邱洪灯，胡云雁，刘霞，等.离子液体在色谱中的应用[J].色谱，2007， 25（3）：293-297.

（收稿日期：2013-05-21，编辑：陈静）