流式荧光杂交法检测女性妇科门诊人群和体检人群的HPV基因型

武汉大学人民医院检验科，湖北武汉 430060

[摘要] 目的 比较女性门诊人群和体检人群人瘤病毒（HPV）感染情况及常见基因型的差异。 方法 采用流式荧光杂交方法检测2098例门诊人群和同期2730例体检人群女性宫颈脱落细胞标本的HPV分型，分析两类人群的HPV感染率、感染类型、常见亚型以及不同年龄段HPV感染类型的差异。 结果 门诊人群和体检人群总感染率为39.37%（826/2098）比17.36%（474/2730），其中单一亚型感染为29.79%比14.17%（高危亚型为25.83%比11.76%，低危亚型为3.96%比2.41%），多重感染为9.58%比3.19%（两重感染占6.82%比2.67%，两重以上感染占2.76%比0.52%）。门诊人群常见的HPV亚型为HPV52（22.03%）、16（19.37%）、58（14.65%）、33（7.51%）、56（7.51%）、6（5.21%）、61（4.12%），体检人群常见的HPV亚型为HPV52（20.46%）、58（15.40%）、61（9.70%）、39（8.02%）、16（7.38%）、68（6.96%）、44（5.27%）。门诊人群和体检人群之间，HPV阳性检出率的差异有统计学意义（χ2=292.03，P < 0.01），且门诊人群多重感染率高于体检人群（χ2=6.244，P < 0.05）。两类人群单一亚型感染以31～50岁为主，多重感染以两重和三重感染为主，但门诊人群比体检人群的四重和五重感染多见；体检人群的两重感染率最高是>40～50岁，而门诊人群的两重感染最高是31～40岁，门诊人群多重感染程度有随年龄增加而加重的趋势。 结论 门诊人群的HPV感染率和多重感染率明显高于体检人群，体检人群HPV感染以52和58亚型为主，门诊人群以52、16和58亚型为主，本院女性门诊人群和体检人群HPV感染有一定的区域特征性。

[关键词] 流式荧光杂交法；人瘤病毒；基因型；感染

[中图分类号] R440 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2013）11（b）-0123-05

Study on the genotyping of human papillomavirus using a method of flow fluorescence hybridization in women from both gynecological outpatient populations and check-up crowd

CHEN Zhanguo LI Yan

Department of Clinical Laboratory， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To compare the difference of infection and genotype in female outpatient populations and check-up crowd with human papillomavirus （HPV）. Methods 2098 cases of cervical exfoliated cell specimens from gynecological outpatients and 2730 cases of identical specimens from check-up crowd were detected by using flow fluorescence hybridization， and the two groups of the overall incidence of HPV， the type of infection， the common subtypes and the distribution characteristics of different age in HPV genotypes were analyzed. Results The overall incidence of HPV in outpatient populations and check-up crowd was 39.37% （826/2098） vs 17.36% （474/2730）， in which a single infection was 29.79% vs 14.17% （high-risk subtype： 25.83% vs 11.76%， low-risk subtype： 3.96% vs 2.41%） and multiple infection was 9.58% vs 3.19% （double infection： 6.82% vs 6.82%， more than double infection： 2.76% vs 0.52%）. The most common HPV subtypes in outpatient populations were HPV-52 （22.03%）， 16 （19.37%）， 58 （14.65%）， 33 （7.51%）， 56 （7.51%）， 6 （5.21%）， and 61 （4.12%）， while in check-up crowd they were HPV-52 （20.46%）， 58 （15.40%）， 61 （9.70%）， 39 （8.02%）， 16 （7.38%）， 68 （6.96%）， and 44 （5.27%）. There was a statistically significant difference in positive rate of HPV between outpatient populations and check-up crowd （χ2=292.03， P < 0.01） and the multiple infection rate in outpatient populations was higher than in check-up crowd （χ2=6.244， P < 0.05）. A single subtype infection of two groups was common in women who was 31 to 50 years old， and the main multiple infection was double and triple infection， while there were more quadruple and quintuple infection in outpatient populations than in check-up crowd. Women who had the highest double infection rate was more than 40 to 50 years old in check-up crowd and 31 to 40 years old in outpatient populations. The degree of multiple infection in outpatient populations increased along with the increase of age. Conclusion Outpatient populations have more HPV infection and multiple infection than that of check-up crowd. The most common HPV subtypes in check-up crowd are 52 and 58， while in outpatient populations they are 52， 16 and 58. Outpatient populations and check-up crowd with HPV infection have their regional characteristic.

[Key words] Flow fluorescence hybridization method； Human papillomavirus； Genotype； Infection

[基金项目] 国家临床重点专科建设项目（编号财社[2010]305号）。

通讯作者

子宫颈癌是危及广大妇女生命的主要杀手，且呈现出年轻化趋势。研究表明，人瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持续感染与子宫颈癌发病密切相关，系统有效的筛查是降低子宫颈癌发病率和病死率的最有效手段[1-3]。目前，HPV已鉴定出100多种型别，根据致病性大小，将HPV分为低危型和高危型两大类。本研究采用流式荧光杂交法检测本院女性门诊人群及体检人群的HPV感染情况及亚型分布，了解两类人群HPV携带的差异，为女性患者的宫颈癌预防筛查和瘤苗研制奠定基础。

1 对象与方法

1.1 对象

研究对象来源于2013年3月～2013年6月武汉大学人民医院（以下简称“我院”）妇科门诊和体检中心；①门诊人群：自愿接受生殖道HPV筛查的妇科门诊女性，共2098例，年龄19～83岁，平均（39.9±9.9）岁；②体检人群：自愿接受生殖道HPV筛查的体检中心女性，共2730例，年龄19～79岁，平均（43.0±9.6）岁。所有研究对象均签署知情同意书。所有研究对象均有性生活史，孕妇和月经期女性不参与本次调查，无子宫切除史和盆腔放疗史，两年内均未进行妇科宫颈手术。采集宫颈脱落细胞标本，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，然后用宫颈刷插入宫颈口，紧贴宫颈口单方向旋转3～5圈，将宫颈刷头部折断放入标本保存液管中，旋紧盖子，贴好医嘱条形码送检（48 h内完成检测）。

1.2 主要仪器和试剂

ABI2720普通扩增仪（美国ABI公司）、Allegra-64R低温高速离心机（美国Beckman-Coulter公司）、Luminex200多功能流式点阵仪（美国Luminex公司）、高危型人瘤病毒核酸检测试剂盒（上海透景生命科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本DNA提取 取混匀的待测标本及阳性质控品200 μL，14 000 r/min离心3 min，弃上清后加入200 μL预先摇匀的提取缓冲液，振荡混匀后置100℃水浴15 min，14 000 r/min离心5 min后，取5 μL上清作为PCR反应模板。

1.3.2 PCR扩增 每个PCR反应体系总体积为20 μL，包括5 μL模板和15 μL PCR试剂，PCR试剂按以下比例配制，即PCR预混液10 μL、引物混合液5 μL、聚合酶0.8 μL。反应参数为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；最后72℃ 3 min。

1.3.3 核酸杂交及荧光素标记 按照样本个数，微孔杂交板中加入22 μL预混的微球杂交液，依此加入3 μL PCR扩增产物至微孔杂交板中，并吹打混匀，封板纸覆盖。95℃变性5 min，48℃杂交30 min。杂交完毕后，小心将封板纸撕下，每孔加入荧光素SA-PE 75 μL，封板纸重新覆盖，轻轻混匀后48℃孵育15 min。

1.3.4 结果判读 将微孔杂交板移至预热好的Luminex 200多功能流式点阵仪上检测，读取微球编码及其对应的荧光强弱信号，经配套分析软件判读检测结果。此法可检测19个高危亚型（即16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、26、53、55、68、82、83）和7个低危亚型（即6、11、40、42、44、61、73）。

1.4 统计学方法

利用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行整理和统计分析，比较门诊人群和体检人群的不同HPV亚型检出率、感染类型及不同年龄组HPV亚型分布特征，检出率以阳性率（%）表示，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 女性门诊人群和体检人群的HPV感染情况及感染类型

门诊人群共2098例，HPV阳性826例，HPV总感染率为39.37%；单一亚型感染625例（29.79%），其中单一高危亚型感染542例（25.83%），单一低危亚型感染83例（3.96%）；多重感染201例（9.58%），其中两重感染143例（6.82%），三重感染41例（1.95%），四重感染12例（0.57%），五重感染5例（0.24%）。体检人群共2730例，HPV阳性474例，HPV总感染率为17.36%；单一亚型感染387例（14.17%），其中单一高危亚型感染321例（11.76%），单一低危亚型感染66例（2.41%）；多重感染87例（3.19%），其中两重感染73例（2.67%），三重感染12例（0.44%），四重感染1例（0.04%），五重感染1例（0.04%）。门诊人群和体检人群之间，HPV阳性检出率的差异有统计学意义（χ2=292.03，P < 0.01），且门诊人群多重亚型感染明显高于体检人群（χ2=6.244，P < 0.05），分别见表1和表2。

表1 门诊人群和体检人群的阳性检出率比较[n（%）]

注：与体检人群比较，χ2=292.03，*P < 0.01；HPV：人瘤病毒

表2 门诊人群和体检人群的单一亚型和多重亚型感染比较[n（%）]

注：与体检人群比较，χ2=6.244，*P < 0.05

2.2 女性门诊人群和体检人群HPV感染者的不同亚型检出情况

两类人群不同HPV亚型按照检出率从高到低排列，见表3。门诊人群HPV感染者，26种亚型均有被检到，高危型前5位HPV52、58、39、16、68，低危型前3位为HPV61、44、6；在体检人群HPV感染者，26种亚型均有被检到，高危型前5位为HPV52、16、58、33、56，而低危型前3位为HPV6、61、11。

表3 门诊人群和体检人群HPV感染者的不同亚型检出情况[%（n1/n1）]

2.3 门诊人群和体检人群HPV感染类型的不同年龄分布

考虑HPV感染的年龄差异，将门诊人群与体检人群按照年龄段分为4组，两类人群的40～50岁组、>50岁组HPV阳性检出率差异均具有统计学意义，χ2值分别为26.52（P < 0.01）、83.54（P < 0.01）、83.93（P < 0.01）、134.98（P < 0.01），详见表4。从表4可见，门诊人群单一高危亚型感染以31～40岁组和>40～50岁组为主，单一低危亚型感染随年龄增加，阳性率有下降趋势，低危型多与高危型多重感染，而多重感染以31～40岁组，>50岁组可见6例四重感染和3例五重感染，门诊人群多重感染程度有随年龄增加而加重的趋势；体检人群单一亚型感染以31～40岁组和>40～50岁组为主，多重感染以两重感染为主，两重感染率最高是>40～50岁组，>50岁组各有检到1例四重和五重感染。

3 讨论

HPV分型对于子宫颈癌癌症筛查、随访监控、疗效评估以及疫苗研发具有重要作用[2]。流式荧光杂交技术是一种液相生物芯片技术，它与其他传统的HPV分型检测方法比较，具有明显的优势，该方法具有操作简便、高通量（1次性96个样本检测）、高灵敏度（低至10拷贝）、重复性好和特异性强等优点，是如今国内检测HPV分型的较理想方法之一[4]。

本研究调查女性门诊人群和体检人群HPV感染的情况，在2098例门诊人群中，证实有HPV阳性826例为HPV阳性携带，其阳性检出率为39.37%，而在2730名女性体检者中，证实有474例为HPV阳性携带，其阳性检出率为17.36%，门诊人群HPV感染率明显高于女性体检人群（P < 0.01），且门诊人群多重亚型感染率高于体检人群（P < 0.05）。体检人群HPV感染以单一感染为主（检出率14.17%），低于门诊人群（29.79%），体检人群HPV多重感染以两重感染和三重感染为主，四重感染和五重感染少见，仅见于2名56岁女性体检者。门诊人群HPV感染虽以单一感染为主（检出率29.79%），其多重感染率（9.58%）明显高于体检人群（3.19%），多重感染以两重和三重感染为主，四重和五重感染例数明显增加。研究结果提示，门诊人群的高单一感染率和多重感染率可能与宫颈病变的严重性相关，应该引起临床重视。HPV感染在不同地区，不同人群中所占的主要型别有所不同，HPV分型检测有利于各地研究、使用疫苗进行HPV感染的预防控制。世界范围不同地区的HPV致病亚型存在较大差异。在中国，HPV16、18、31、33、45和58等亚型均有报道，全国各地区总体以HPV16为主[5-7]，而HPV58的检出率有升高的趋势，有些地区与HPV16几乎持平，我国地域辽阔，不同民族和地区之间也存在差异。在本研究中，在门诊人群与体检人群均有检到26种HPV亚型，体检人群高危型以HPV52、58、39、16、68为主，低危型以HPV61和44为主，HPV26阳性见于两重亚型感染者（即HPV26和53），而HPV73阳性见于四重亚型感染者（即HPV45、52、56和73）。门诊人群高危型则以HPV52、16、58、33、56为主，低危型以HPV6和61为主。体检人群携带的主要基因型为HPV52（20.46%）和58（15.40%），门诊人群携带的主要基因型为HPV52（22.03%）、16（19.37%）和58（14.65%），说明了本院女性HPV52和HPV58亚型具有较高人群感染率。另外，门诊人群HPV16感染率略微低于HPV52，HPV6是最常见的低危型，且大都与其他高危型混合感染，本研究认为高危型HPV16和低危型HPV6可能与门诊人群的宫颈癌致病性相关。以上主要亚型检出率与国内其他文献报道的略有差异[5-7]，但也验证了HPV58具有较高的人群感染率[8-9]，HPV52高感染率也说明了女性HPV感染的严重程度以及感染的亚型分布与区域流行密切相关[10-15]。

宫颈癌是目前唯一病因明确的恶性肿瘤，是目前唯一可以预防的恶性肿瘤。本研究对本地区女性门诊人群与体检人群HPV感染者不同年龄分布进行分析，两类人群单一亚型感染（包括高危型和低危型）以31～40岁组和>40～50岁组为主，说明了31～50岁之间的女性HPV感染率保持相对稳定的水平和HPV感染难清除性。另外，体检人群多重感染以两重和三重感染为主，两重感染率最高是>40～50岁组，四重和五重感染少见；门诊人群多重感染以31～40岁组主，多重感染程度随年龄增加而加重的趋势。这提示了，女性在>40～50岁年龄段HPV携带率较高，特别是HPV高危亚型及多重感染者，HPV分型检测应结合细胞学检查，应建议患者进行妇科随访，若连续两次HPV分型检测显示单一型别的高危亚型感染，提示宫颈癌发生的可能性很大，应引起极大重视。HPV基因分型检测结果对宫颈病变患者手术前后随访提供依据，若治疗前后HPV为同一亚型阳性，复发的可能性大，如果是其他亚型阳性，则为重复感染，手术病灶切除干净。

总之，我院女性门诊人群与体检人群HPV感染者的基因型有地区特征性，单一感染以高危亚型感染为主，混合感染以两重亚型感染为主，31～50岁之间HPV感染率最高，但门诊人群的HPV阳性检出率和多重感染率高于体检人群，且所感染的主要基因型也有所不同，主要HPV亚型可能与致病性相关。

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（收稿日期：2013-08-21 本文编辑：卫 轲）