低密度脂蛋白测定方法的进展

摘要：血清或血浆中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与冠心病（CDH）发生和动脉粥样硬化损伤呈正相关，而且是美国国家胆固醇教育计划（NCEP）作为脂类疾病分类和风险预测的一个重要指标。LDL-C也是选择药物治疗和预后方面的一个十分有意义的临床指标，国内外都在研究和开发行之有效、可靠的标准化测定方法。本文对其有关的测定方法和研究进展作综述。

关键词：低密度脂蛋白胆固醇 方法学 心血管疾病

临床和流行病学研究证明血清中LDL-C与冠状动脉粥样硬化有密切的正相关[1]。在1986年病理学家们就研究证明LDL-C浓度越高时动脉粥样硬化损伤的程度越大，粥样硬化程度小时，测到血清中LDL-C也低[2，3]。

LDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，一般认为LDL的漂浮密度为1.006～1.063，且包括了中间密度脂蛋白（LDL）1.006～1.019及Lp（a）1.050～1.080。LDL中蛋白含量约为20%～25%，主要是载脂蛋白B-100（ApoB-100），而载脂蛋白E（ApoE）和载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）含量很少。胆固醇的含量约是血清中总量的三分之二。LDL是通过受体途径进行降解，如过量时可以导致巨噬细胞和其他吞噬细胞变成泡沫细胞，这被认为是与动脉粥样硬化有关的因素。因此，LDL-C的测定结果直接影响到分类和治疗。美国的NCEP专家组以LDL-C浓度将成人、小孩、青少年各分为：成人在3.37mmol/L（1300mg/L）以下为合适水平，在3.37～4.12mmol/L（1300～1590mg/L）间作为中危水平，高于4.14mmol/L（1600mg/L）时作为高危水平；小孩和青少年在2.85mmol/L（1100mg/L）以下为合适水平，在2.85～3.34 mmol/L（1100-1290mg/L）为中危水平，高于3.37mmol/L （1300mg/L）为高危水平[4]。为提高LDL-C测检水平，国内外对LDL-C测定方法进行广泛的研究并不断改善，现将有关方法研究进展综述如下：

1、等密度和密度梯度超速离心法

血清中的各种脂蛋白的分离是LDL-C测定的一个重要环节。由于各种脂蛋白的大小、密度和组成及功能都有很大的不同。超速离心技术就是利用脂蛋白各种成分的密度不同将它们分离，是脂蛋白分离的主要方法。

1950年Delalla和Gofman首次报道等密度超速离心法。在实验室中一般采用βQuantification（βQ）法，它利用1.006的临界分离液，在离心力为10900g时离心18h，将血浆分成上下两部分，上清液为VLDL和乳糜颗粒，下面为IDL、LDL和HDL。用试管切开技术将上下液体分开。下面部分再采用化学沉淀法将HDL和LDL及IDL分开，分别用酶法测定胆固醇。这方法已被临床实验室作为参考方法。而且还可以根据需要改变分离液密度，当密度提高为1.019，可以将IDL与LDL和HDL分开，也可提高到1.21，分离出HDL等。但在选择脂蛋白分离切点系指它们与缓冲液混和物的密度，而不是脂蛋白自身的密度。

另外有报道用密度梯度超速离心法。这种方法是将血清加入到已有不同密度梯度的分离液中，进行超速离心后，血清中脂蛋白的各种成份可以转移到各自相等密度的相等的区域。这种方法可以一次将脂蛋白中的各种成份分离。而不足之处是要求离心时间很严格，分开各种组份较困难。根据离心转子的不同，可以分为水平转子，垂直转子以及固定角度转子。水平转子在实验中已被证明分离效果最好，但要求离心时间长（17～66h）；垂直转子可以缩短时间（45min～3h），由于转动距离小，会有微量丢失；在等密度超速离心中首选固定角度转子，如在密度梯度超速离心中使用时，离心时间要比垂直转子稍长。

这两种方法对实验室要求条件高，一般实验室都难以应用。虽然现在有很多改良方法，克服了传统方法的部分缺点，但分离的效果仍不能同传统方法比。所有的超速离心法都有它们的局限性，它们所测得的结果仍是NCEP作为分类和治疗的指标。

2、谱法

根据脂蛋白分子的大小和亲和性有很大的不同，利用层析技术对脂蛋白进行分离。目前有多种色谱仪和分离柱被用于脂蛋白的分离。而琼脂糖层析技术和Toya soda的高压凝胶层析技术使用最普遍。这种方法是非破坏性，可以回收各种成份，有报道[6]LDL-C的回收率可以达到80%～98%，但稳定性较差。目前这种技术也在不断完善，但要求实验条件高，操作繁琐，时间长，仪器昂贵，难以在临床实验室应用。

3、电泳

电泳技术是基于脂蛋白分子所带的电荷和分子量大小不同进行分离，早期这种技术在临床实验室普遍用于定性分析，直接观察血清脂蛋白谱。现在已不再推广使用，大量实验证明电泳电量法所得的结果不能令人满意，并且发现与常规实验测得的结果有误差。有报道[7] 肝硬化胆道阻塞病人的血清脂蛋白谱显示正常，而血清胆固醇浓度追忆忼于25.9mmol/L（10g/L）。因此还应进行总胆固醇（TC）测定。因为亲脂性染料不能和游离胆固醇以及磷脂结合。另外，可以与超速离心法和化学沉淀法联合使用，经分离后，进行某一组份纯度分析。免疫与电泳技术结合，可以大大提高准确度；以及全自动电泳分析仪出现，在常规实验室进行脂蛋白定量分析将成为可能。

4、化学沉淀法

肝素沉淀法。肝素在pH值5.12柠檬酸缓冲液中可以沉淀LDL，使LDL与其它脂蛋白分离，然后进行胆固醇测定。这种方法pH值很重要。pH值必须使LDL颗粒的脂蛋白所带电荷刚为正值。由于VLDL和LDL等电点分别为4.7和5.4，pH值5.12±0.02时LDL刚好可以完全沉淀，而VLDL不沉淀。肝素沉淀法与定量电泳法有很好的一致性，但当TG含量大于4.58mmol/L（4000mg/L）时，一致性相对降低。在Ⅲ型血浆脂蛋白增高症的病人血清中加沉淀剂时VLDL和Lp（a）与LDL发生共同沉淀，导致结果出现偏差。这种方法在TG低时，它有很好的精密度，变异系数小于3.5%。与等密度超速离心法比较，当TG浓度大于2.0mmol/L（1750mg/L）时，肝素法出现结果偏离[4]。近年Armstrong等[8]实验证明降低pH值到4.85时Lp（a）沉淀。