一株纤维素降解菌的筛选与酶活力测定

摘 要：从吉林市左家林地土壤中分离得到一株纤维素酶产生菌，由形态观察和18S rDNA序列分析，该菌株为真菌，属散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes），命名为JN510。该菌产生纤维素酶活力为2.32IU/mL，具有进一步研究价值。

关键词：纤维素酶；菌种筛选；鉴定；酶活力

中图分类号： Q936 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001

纤维素是农作物秸秆的主要成分之一，也是地球上含量最为丰富的可降解生物质，其为葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷键聚合。它的降解与转化是生物圈碳素循环与生物能传递的重要环节。利用微生物对纤维素进行降解，对于自然界生物能源的利用具有重要意义。世界各国均积极开展对纤维素降解菌的研究[1]。东北地区作为我国的粮食主产区，每年产生大量富含纤维素的农业秸秆，传统的焚烧污染环境且造成大量生物质浪费。

本试验从吉林市左家林地土壤中分离出一株纤维素降解菌，由菌丝、菌落形态以及16S rDNA初步鉴定为散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有较强纤维素酶产酶活性，对于纤维素的降解转化具有积极意义，菌种具有进一步研究价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 试验材料

土壤样品，采自吉林省吉林市左家地区林地；化学试剂均为分析纯，购于北京化学试剂厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝胶回收试剂盒，购自BioFlux公司；

1.1.2 培养基

富集培养基：MgSO・7H2O 4 0.1g，FeSO4・7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。

刚果红筛选培养基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸馏水500ml，加热溶解后加入CMC-Na 20.0g、琼脂20.0g、刚果红0.2g充分溶解后，蒸馏水定容至1000ml，HCl调pH直至达到7.0～7.2，121℃灭菌30min，摇匀后倒平板。

纤维素钠筛选培养基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂12.0g，，水 1000ml，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。

产酶培养基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，FeSO4・7H2O 0.01g，MgSO4・7H2O 0.5g，MnSO4・H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl调pH值7.0～ 7.2，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。

PDA培养基：马铃薯200g，去皮切成小块，用蒸馏水1000ml小火沸煮30min，8层纱布过滤，滤液补水至1000ml，调pH6.5。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集与菌种分离

于左家地区林地，取腐殖质表层土壤5g土样于三角瓶中，加入50ml无菌水，震荡5min，至分散均匀。取5ml悬液于50ml富集培养基，28℃，80r/min震荡培养5～7d。取富集培养液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释，涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，分离有明显透明水解圈的菌落。若菌落重叠可划线分离菌株。

1.2.2 菌株纤维素降解能力测定

将分离获得的菌株，液体培养后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释后涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，待菌落直径1.0～5.0mm，取下培养基，于1%刚果红溶液浸泡1h，弃去刚果红溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，弃去NaCl溶液，观察并测量水解圈大小。

1.2.3 纤维素酶活力测定

采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶活力 [2]。酶活力定义为：1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1IU。

1.2.4 菌株表型特征鉴定

取无菌水一滴至于干净玻片，接种环挑取少许菌丝涂布，风干固定，显微观察菌株形态。

1.2.5 菌株的18S r DNA鉴定

CTAB法提取菌株基因组DNA，分析18S r DNA进行军中鉴定。PCR反应体系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d NTP4.0μL，FP2μL，RP2μL，Taq酶 1μL，模板DNA 2μL。引物序列：FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；RP 3' CCCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反应条件：94℃，5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环； 72℃，10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，送至英潍捷基公司测序。序列于GeneBank由BLAST进行序列同源性分析，确定菌种属。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离和纤维素降解能力初步鉴定结果

由刚果红筛选培养基水解圈初步判断，实验分离得到多种具有纤维素降解能力的菌株。其中3种疑似真菌类菌株，具有较为明显纤维素降解能力。

取这3种菌株，于刚果红筛选培养，用1%刚果红溶液浸泡后1mol/L NaCl溶液浸泡脱色，测量水解圈大小，结果见表1。由表1可知，1号菌水解圈直径/菌落直径为8.8，远高于2号菌和3号菌。初步表明，1号菌具有较明显纤维素降解能力。

2.2 菌株的纤维素酶活力测定结果

取1号菌、2号菌、3号菌，DNS法测定纤维素酶活力，结果见图1。由图1可知，在3种菌株中，1号菌纤维素酶活力最高，为2.32IU/mL。将1号菌命名为JN510。由纤维素酶活力判断，其具有进一步研究的价值。

2.3 JN510菌株表型特征鉴定结果

JN510菌株于PDA培养基28℃下培养，生长快速。3d后呈白色绒毛状气生菌丝；继续培养，菌落转为绿褐色；继而颜色逐渐加深。菌落毛绒状。镜检结果见图2。

2.4 18S rDNA序列分析结果

JN510菌株基因组 DNA进行PCR 扩增，产物进行琼脂糖电泳，结果见图3。由图可知，引物对18S r DNA 序列扩增效果良好，扩增片段约500bp。

回收片段，送英潍捷基公司测序。获得序列经GeneBank比对，该菌种与序列号为EU368286.1的Uncultured Eurotiomycetes具有99%的亲缘关系，结合文献所列形态学特征的描述，将其鉴定为散囊菌纲（Uncultured Eurotiomycetes）[3，4]。

3 讨论

吉林市左家地区林地腐殖质表层土壤中存在大量可以降解纤维素的纤维素酶产生菌。其可应用于生物化工过程，如秸秆发酵生产燃料乙醇等工艺。这些菌对于富含纤维素的的转化利用以及农业秸秆回收利用具有重要意义。

纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3者协同作用降解纤维素生成葡萄糖。不同菌种产生上述3种酶的浓度与活力不同。虽然自然界中纤维素降解菌种类较多，但是秸秆等生物质中的纤维素往往与木质素、脂质等交联存在。使得自然界中纤维素降解菌的降解能力不理想，降低了秸秆等富含纤维素生物质的开发利用。因此可以考虑构建不同纤维素降解菌，以及纤维素降解菌与木质素降解菌等降解菌的混合菌系。以此来转化纤维素，提高降解效率。

本实验获得的纤维素降解菌JN510具有较强纤维素降解能力，具有良好的开发前景，值得进一步研究。

参考文献

[1]顿宝庆，吴薇，王旭静，等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技导报，2008，10（1）：113-117.

[2] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J]. Pure Appl Chem， 1987， 59（2）： 257- 268.

[3] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1979：129-135.

[4] 戴芳澜. 中国真菌总汇[M]. 北京： 科学出版社，1979：1527.

作者简介：叶飞（1978-），男，副教授，主要从事应用微生物学研究。