复方益母口服液中水溶性生物碱-盐酸水苏碱的HPLC法测定研究

[摘要] 目的 建立复方益母口服液中水溶性生物碱-盐酸水苏碱的含量测定方法。 方法 用雷氏盐沉淀法处理样品，对提纯出的盐酸水苏碱采用HPLC法测定含量。色谱柱为Agela Venusil XBP NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-醋酸溶液（用少量醋酸调节溶液的pH值至3.00±0.15）（77∶23）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，检测波长200 nm。 结果 复方益母口服液中盐酸水苏碱的进样量在1.083 1～32.491 8 μg范围内线性关系良好（r = 0.999 9），平均回收率为91.1%，RSD = 3.7%（n = 6）。 结论 该方法精确可靠，专属性强，可作为复方益母口服液中盐酸水苏碱的质量控制方法。

[关键词] 复方益母口服液；HPLC法；盐酸水苏碱；雷氏盐沉淀法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）06（a）-0063-03

Determination of water soluble alkaloids-stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid by HPLC

LV Haihong

Institute for Food and Drug Control of Henan Province, Zhengzhou 450003, China

[Abstract] Objective To establish a method for the content determination of water soluble alkaloids-stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid. Methods The sample solution was prepared with the method of Reinecke salt precipitation and was determined the content by HPLC. The column was Agela Venusil XBP NH2 column (4.6 mm×250 mm，5 μm) and CH3CN-H2O (pH was adjusted to 3.00±0.15 by acetic acid) (77∶23) was used as the mobile phase, with the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was at 35℃ and the detection wavelength was 200 nm. Results The good linear ranges were between 1.083 1-32.491 8 μg for stachydrine hydrochloride (r = 0.999 9, n = 6) and the average rate of recovery was 91.1% with RSD = 3.7% (n = 6). Conclusion The method is accurate, reliable, specific and with good reproducibility. It can be used for the quality control of stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid.

[Key words] Complex Yimｕ Ｏｒａｌ Liquid; Stachydrine hydrochloride; HPLC; Reinecke salt precipitation

复方益母口服液是由益母草、当归、川芎等药经加工制成的口服液，具有活血行气，化瘀止痛的功能，用于气滞血瘀所致的痛经，原为国家药品标准新药转正标准第19册收载品种[1]。益母草是君药，其指标性成分是盐酸水苏碱，原标准采用薄层扫描法（TLCS）测定水苏碱含量，由于方剂中并存其他的生物碱，TLCS法对水苏碱的选择性和专属性均差，含量不准确。为此，特研究起草了HPLC法测定复方益母口服液中盐酸水苏碱的含量，专属性强，准确性好，可为标准提高提供修订依据。

1 仪器与试药

戴安高效液相色谱仪UltiMate3000系列。盐酸水苏碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110712-200709，供含量测定用）；复方益母口服液由河南太龙药业股份有限公司生产，批号为10121512、10072011、10031315，水为纯化水，甲醇为色谱纯，醋酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：Agela Venusil XBP NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A∶B=乙腈-醋酸溶液（用少量醋酸调接溶液的pH值至3.00±0.15）（77∶23），柱温：35℃；检测波长：200 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。理论板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于5 000。

2.2 对照品溶液的制备

取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加流动相B制成每1毫升含0.5 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品10 mL，用稀盐酸调节pH值至2.0，加入新制的2%雷氏盐溶液10 mL，冰浴中放置1 h，用G4垂熔玻璃漏斗滤过，沉淀用冰水30 mL洗涤后，用丙酮溶解。向丙酮液中加等体积的水，摇匀，滴加1%硫酸银溶液至不再有沉淀生成，离心（每分钟2 000 r以上，1～2 min，下同），倾出上清液，沉淀用丙酮1～2 mL洗涤，离心，合并两次上清液并适当浓缩至5 mL。再向浓缩液中滴加2%氯化钡溶液至不再有沉淀生成，离心，倾出上清液，沉淀用水1～2 mL洗涤，离心，合并两次上清液并蒸至近干，用水全部转移至10 mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

依据处方中的比例，按制法制备缺益母草药材的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.5 系统适应性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图1）。结果阴性对照溶液在盐酸水苏碱色谱峰相应的保留时间处无色谱峰出现，供试品溶液在相应的保留时间处有色谱峰出现，并且与相邻峰的分离度大于1.5，表明所建立方法的专属性高，杂质对主成分的测定无干扰。

2.5.1 线性关系考察。配制浓度为0.541 53 mg/mL的对照品溶液，分别精密吸取2、4、7、10、20、30、40、50、60 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值A为纵坐标，对照品量X（μg）为横坐标，作线性回归，得回归方程A = 1.762 8X + 0.405 8，r ＝ 0.999 9。结果表明，盐酸水苏碱在1.083 1～32.491 8 μg范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验。取同一份对照品溶液，重复进样6次，进样量20 μL，测定峰面积，计算其相对标准偏差RSD = 1.1%。表明精密度良好。

2.5.3 重现性试验。取同一批号（批号：10031315）供试品，按供试品溶液制备方法制备6份供试液，分别测定盐酸水苏碱含量，结果平均含量为0.873 mg/mL，RSD = 3.1%。表明重复性较好。

2.5.4 稳定性试验。取同一份对照品溶液，于0、2、5、8、11、15 h分别进样，测定盐酸水苏碱峰面积，并计算相对标准偏差，结果峰面积RSD = 1.8%。表明供试品溶液在15 h内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验。精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加流动相B制成2.036 43 mg/mL的对照品溶液。精密量取已知含量的供试品（批号10031315，含量0.848 mg/mL）5 mL共6份，分别精密加入上述盐酸水苏碱对照品溶液1 mL，按供试品溶液的制备方法制备供试液，分别进行测定，计算加样回收率。结果见表1。

由于供试品溶液的制备过程反应多，步骤较繁琐，前处理中的一些损失会对回收率高低有一定影响，考虑到方法重现性较好，回收率结果较稳定，所建立方法是可行的。

2.5.6 耐用性试验。换用不同厂家的色谱柱，通过微调流动相比例和pH值，每根柱子的系统适用性实验均可达到满意的结果。所用的色谱柱a：Lanbo的Kromasil NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm；柱b：依利特的Hypersil NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm；柱c：Agilent的ZORBAX NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm。

2.6 样品含量测定

取复方益母口服液3批（批号：10121512、10072011、10031315），按“2.2”、“2.3”项下方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，进样20 μL，记录峰面积，按外标法计算含量，结果3批盐酸水苏碱的含量分别为0.892、0.958、0.848 mg/mL。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 本文色谱条件筛选时曾采用C18柱分离，因盐酸水苏碱极性较大，结果在C18柱上保留很小；后采用氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱则保留时间适宜，色谱峰分离较好。

3.1.2 从盐酸水苏碱对照品溶液紫外光谱图知盐酸水苏碱最大吸收为192 nm，属于末端吸收，为提高检测灵敏度，故采用截止波长较低的乙腈（190 nm）为有机相，测定波长定为200 nm。

3.1.3 流动相B采用醋酸溶液，实验中发现pH值对盐酸水苏碱峰形影响较大，当从pH 6到pH 2.5范围变化时，色谱峰形从拖尾变化为前延，其中在pH 3.00±0.15处可获得对称峰，可用少量醋酸来调接溶液的pH值。改变A∶B为60∶40、75∶25、77∶23、80∶23，试验不同的流动相比例，以77∶23时盐酸水苏碱峰与邻近峰分离度好，保留时间适宜，为最佳。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

3.2.1 益母草药材及含益母草制剂大多以盐酸水苏碱作为定量指标，而盐酸水苏碱是水溶性生物碱，易溶于水，从供试品前处理的操作上看，对于药材及固体制剂如片剂、胶囊、颗粒剂、膏剂等，大多利用盐酸水苏碱的水溶性，只需简单的醇提水沉或活性炭除杂、固相萃取小柱等除杂，即可除掉大部分杂质，进而进行后续的分析测定[2-4]。但对于溶液状制剂如口服液、合剂等，盐酸水苏碱已存在于水相中，无法利用其水溶性特点直接提取测定，文献[5-8]多采用雷氏盐沉淀法除杂提纯。在供试液配制方法筛选之初，尝试采用口服液样品稀释后直接进样，但出峰杂乱，共存成分对主峰干扰太大；采用口服液样品用乙酸乙酯或氯仿或正丁醇提取除杂后进样，结果未有改善；最后仍采用此类水溶性生物碱的经典测定方法，通过雷氏盐-硫酸银-氯化钡法除杂并制得主要成分为盐酸水苏碱的进样溶液，注入HPLC仪分析，得到的HPLC色谱图杂质峰少，专属性强，也有较好的重现性和回收率。

3.2.2 雷氏盐沉淀法操作步骤较多，每步都需谨慎操作，才能得到较好的重现性。本法经多次试验，细化并改进了操作步骤，使方法更具操作性、可控性和重现性。与原法[1]比较，有以下改进：（1）用少量稀盐酸调节pH值即可，可减少浓盐酸的挥发及利于调节pH值。（2）明确了垂熔玻璃漏斗为G4，保证重现性。（3）冰水洗涤由10 mL改为30 mL，较充分洗去杂质。（4）滴加硫酸银溶液前丙酮提取液先加等体积水改变溶剂性质，有效改变了原方法滴加硫酸银水溶液到有机溶剂中初期因溶解度改变而有沉淀析出的干扰。（5）滴加硫酸银溶液浓度由0.5%改为1%，使滴加溶液尽量减少，利于后面浓缩操作。（6）边滴加反应液，边沉淀，边离心的操作，可清楚观察到反应结束，即不再有沉淀生成。（7）滴加氯化钡的操作改进和思路同上述（5）和（6）。

将含量测定方法由TLCS法改为HPLC法，具有操作简便、选择性和专属性强，准确性好的特点，可用于复方益母口服液的质量控制；而在以后的研究中，将对复方益母口服液中水溶性生物碱的简便、快速、准确的前处理方法做进一步的探索。

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（收稿日期：2012-03-27 本文编辑：赵丽萍）