Ⅳ型胶原酶心包经上预处理对“内关”穴注射胰岛素后降糖作用及GLUT4表达分布的影响

(南通医学院药理学教研室,江苏226001)

[摘要]目的:研究Ⅳ型胶原酶心包经上预处理对小鼠“内关”穴注射胰岛素后降糖作用及GLUT4表达、分布的影响。

方法:小鼠“内关”穴上方5mm心包经上注射Ⅳ型胶原酶,30min后,“内关”穴注射胰岛素,间隔5min后测血糖,取骨骼肌用Northernblot方法观察GLUT4mRNA表达,免疫组化法研究GLUT4分布,并与心包经旁预处理组、蒸馏水心包经上预处理组相比较。

结果:Ⅳ型胶原酶心包经上预处理几乎完全阻断“内关”穴注射胰岛素的降糖效应,其对骨骼肌GLUT4mRNA表达无影响,但可使GLUT4从胞内储存部位向细胞膜转运减少。

结论:Ⅳ型胶原蛋白参与了从胰岛素穴位注射到GLUT4再分布进而产生快速降糖作用之间的信息传递。

[主题词]梭菌胶原酶/投药和剂量;心胞经;穴,内关;血糖;胰岛素/投药和剂量

EffectsofPretreatmentofCollagenaseⅣinPericardiumChannelon

DecreaseofPlasmaGlucoseLevelandExpressionandDistributi

onofGLUT4afterInjectionofInsulininto“Neiguan”

PointQianDongsheng,ZhuYifang,LuoLin,etal(Departmentof

Pharmacology,NantongMedicalCollege,Jiangsu226001)

[Abstract]PurposeToobservetheeffectofpret

reamentofcollagenaseⅣinthePericardiumChannelondecreaseofplasmaglucosel

evel,expressionofGLUT4mRNAanddistributionofGLUT4a

fterinjectionofinsulininto“Neiguan”

(PC6).MethodsCollagenaseⅣwasinjectedintothePericar

diumChannel5mmabove“Neiguan”(PC6)inthemouse,andinsulinwasinjectedinto

“Neiguan”(PC6)30minuteslater.After5minutes,plasmaglucoselevelwasdete

rmined.Meanwhile,expressionofGLUT4mRN

AanddistributionofGLUT4inskeletalmuscleswereinvesti

gatedwithNorthernblotanalysisandimmunohistochemicalmethod.ResultsP

retreatmentofcollagenaseⅣinthePericardium

Channelalmostentirelyblockedtheeffectofreductiono

fplasmaglucoselevelduetoins

ulininjectioninto“Neiguan”point.Althoughitdidnotaffect

theexpressionofGLUT4mRNA,theGLUT4incytoplasmicmembranewasdecr

easedmarkedly.ConclusionCo

llagenⅣmayparticipateinthemessagetransmissionfrominsulini

njectiontotherapiddecreaseofplasmaglucoselevel

causedbyredistributionofGLUT4.

[Keywords]ClostrdiumHistolyticumCollagenase/admin;

PericardiumMeridian;PointPC6(Neiguan);BloodGlucose;Insulin/admin

国家自然科学基金资助项目(39770896)经穴现象是客观存在的,但是其实质尚不清楚。胶原蛋白为细胞外间质的主要组成成分,不仅参与细胞运动、增殖和分化等细胞行为,而且介导细胞与细胞,细胞与生物分子间的作用[1]。胶原蛋白是否参与药物穴位注射后的信息传递尚未见文献报道。本课题组初步研究表明,“内关”穴注射药物后的药效变化与胶原蛋白特别是Ⅳ型胶原有关[2]。本研究拟在心包经上用Ⅳ型胶原酶预处理,观察其对“内关”穴注射胰岛素后降糖作用以及葡萄糖转运体蛋白4(glucosetransporter4,GLUT4)表达和分布的影响,以进一步证明胶原在经络信息传递过程中的作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物ICR小鼠,20±2g,雌雄各半,由南通医学院实验动物中心提供,合格证:苏动(质)98025,苏动(环)98062。

1.1.2试剂Ⅳ型胶原酶(Sigma公司);胰岛素(徐州万邦生物化学制药厂,批号:990524);限制性核酸内切酶购自华美生物工程公司;Trizol试剂为Gibco公司产品;HybondN+尼龙膜为Amersham公司产品,随机引物标记试剂盒购自Promega公司;[α32P]dCTP购自北京亚辉公司;含葡萄糖转运体4(GLUT4)cDNA质粒,由南通医学院分子生物学研究室郑震林博士惠赠;含3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA质粒,由南通医学院生物化学教研室刘飞博士惠赠;山羊抗GLUT4多克隆抗体和HRP标记驴抗山羊二抗购自SantaCruz公司;ABC试剂盒购自武汉博士德公司,其余试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1分组及测定血糖取禁食12小时的ICR小鼠,用OneTouchⅡ型血糖测定仪(强生中国公司产品)测定空腹血糖水平,然后随机分为3组,每组10只,雌雄各半。①Ⅳ型胶原酶经上预处理组(A组):“内关”穴上方5mm,心包经上注射Ⅳ型胶原酶0.1mg(0.02ml);②Ⅳ型胶原酶经旁预处理组(B组):“内关”穴上方5mm,心包经旁开2mm处注射Ⅳ型胶原酶0.1mg(0.02ml);③对照组(C组):“内关”穴上方5mm,心包经上注射蒸馏水0.02ml。各组动物均在预处理30min后“内关”穴注射胰岛素0.05ml(2U),5min后,测定血糖,观察各组血糖下降百分率。

2.2RNA提取及Northernblot分析上述动物测血糖后立即处死,迅速取大腿肌肉组织,用Trizol试剂提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度,总RNA经甲醛变性胶电泳后,毛细管法转移至尼龙膜,80℃固定2h。含GLUT4cDNA质粒经扩增、提取、酶切、电泳、回收,得到GLUT4cDNA,随机引物标记[α32P]dCTP。尼龙膜于65℃预杂交、杂交(预杂交液:0.2M磷酸盐buffer(pH7.2)、1mMEDTA、1%BSA、7%SDS、15%甲酰胺),洗膜后-70℃放射自显影,所有样膜经洗脱探针后用GAPDHcDNA探针再杂交,作内参照以校正RNA上样量,最后图像分析杂交信号进行光密度(A值)扫描。

2.3免疫组化实验取大腿肌肉组织石蜡包埋后切片,厚4～5μm。切片经二甲苯脱蜡、系列酒精水化,0.1mol/LpH7.4PBS缓冲液洗涤3次,滴加蒸馏水新鲜配制的3%H2O2,室温5～10min,以消除内源性过氧化物酶;PBS洗3次后,用正常血清封闭,室温10min;吸去正常血清,滴加1∶50山羊抗GLUT4多克隆抗体,4℃过夜,PBS洗3次;滴加HRP驴抗山羊IgG(1∶200),37℃30min;PBS洗3次后加ABC试剂,37℃30min,0.01MPBS洗3次,加DAB显色液,室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤,苏木精复染,分色,系列酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

3结果

3.1Ⅳ型胶原酶心包经上预处理对小鼠“内关”穴注射胰岛素后降糖作用的影响结果见表1。Ⅳ型胶原酶“内关”穴上方心包经上预处理几乎完全阻断“内关”穴注射胰岛素后5min的降糖效应,而同等剂量Ⅳ型胶原酶“内关”穴上方心包经旁预处理对“内关”穴注射胰岛素后的降糖作用与对照组相比无明显差异。

3.3免疫组化实验结果见图2(见封3)。3组动物骨骼肌细胞胞浆呈棕色反应,但Ⅳ型胶原酶经旁预处理组(图2B)及对照组(图2C)骨骼肌细胞胞浆膜上棕色线条较深,表明GLUT4在胞浆膜上有较多分布,Ⅳ型胶原酶经上预处理组(图2A)骨骼肌细胞胞浆膜上棕色线条较浅,表明GLUT4在胞浆膜上分布较少。

4讨论

胰岛素小剂量穴位注射具有快速强大的降糖作用,其初始药效与静脉注射同等剂量该药相当,与血药浓度、神经系统的完整性无明显相关,这已为诸多实验所证实[3～5]。胶原蛋白为细胞外间质的主要组成部分,已有初步实验表明,Ⅳ型胶原与经络信息传递有密切的关系[2]。本实验结果表明,用Ⅳ型胶原酶心包经上预处理,能明显阻断胰岛素穴位注射的降糖效应,Ⅳ型胶原酶心包经旁预处理组的阻断作用不明显,这更进一步证明了上述观点。

葡萄糖跨膜转运是由葡萄糖转运体家族(glucosetransporters,GLUTs)实现的。在肌肉等组织,胰岛素刺激快速显著的葡萄糖跨膜转运,这主要是由于GLUT4再分布造成的。在胰岛素作用下,GLUT4迅速从细胞内储存部位分布到细胞膜上,发挥转运葡萄糖的作用[6,7]。但未见胰岛素穴位注射后GLUT4表达和分布的变化以及Ⅳ型胶原酶对其影响的报道。

本研究中,3组动物GLUT4mRNA的表达没有明显变化。免疫组化研究显示,3组动物骨骼肌细胞胞浆呈棕色反应,Ⅳ型胶原酶经上预处理组骨骼肌细胞胞浆膜上棕色线条较浅,表明GLUT4在胞浆膜上分布较少,而Ⅳ型胶原酶经旁预处理组及对照组骨骼肌细胞胞浆膜上棕色线条较深,表明GLUT4在胞浆膜上有较多分布。

本研究结果提示,胰岛素“内关穴”注射后,产生快速降糖作用,而这种降糖作用的机理不是由于GLUT4产生增加,而主要是由于GLUT4再分布造成的。用Ⅳ型胶原酶心包经上预处理,能明显阻断胰岛素穴位注射的降糖效应,亦能减少GLUT4自胞内储存部位向胞浆膜上转运。我们认为Ⅳ型胶原蛋白参与了从胰岛素穴位注射到GLUT4再分布进而产生快速降糖作用之间的信息传递过程,至于Ⅳ型胶原蛋白如何参与信息传递有待进一步研究。

5参考文献

1刘秉慈.细胞外间质.生理科学进展,1996;27(3):221

2邵政一,朱毅芳,陈霞.胶原酶预处理对内关穴注射胰岛素降糖作用影响.中国针灸,2000;20(3):169

3邵政一,刘祖舜,丁斐,等.“内关”穴注射胰岛素对去臂丛神经小鼠、STZ糖尿病小鼠的降糖作用及其对胰高血糖素拮抗作用的研究.现代应用药学,1987;4(4):7

4丁斐,刘祖舜.大鼠内关注射去甲肾上腺素升压作用机理初探.南通医学院学报,1996;16(1):9

5徐济良,黄金华,邵政一.大鼠内关注射肾上腺素对血流动力学与血药浓度的影响.南通医学院学报,2000;20(1):20

6Livingstone,C,Lyall,H,andGould,G.W.HypothalamicGLUT4Expression:aGlucoseandInsulin

SensingMechanism?Mol.Endocrinol.1995;107:677Marsh,B.J,Alm,R.A,Mclntosh,S.R,etal.Molecu

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(收稿日期:20000916,齐淑兰发稿)