加味五皮饮对OHSS模型大鼠E2、IL―6和VEGF的实验研究

摘要：目的 观察加味五皮饮是否能够抑制OHSS模型大鼠外周血清IL-6和E2水平，能否降低OHSS模型大鼠卵巢重量、VEGF蛋白在卵巢上表达水平，从而对OHSS的发生起到防治作用。方法 选用未成年雌性Wistar大鼠30只，随机分成模型中药组、模型对照组每组15只。将两组未成年雌性Wistar大鼠采用PMSG+hCG方式建立OHSS模型，同时给予加味五皮饮和生理盐水灌胃。HCG注射48h后，沿腹部中线切开腹腔，取出大鼠双侧卵巢称重，采用免疫组化对大鼠卵巢组织VEGF蛋白表达的测定；分别用ELISA和RIA检测血清中IL-6和E2水平。结果 模型中药组卵巢重量、卵巢VEGF蛋白表达、血清E2和IL-6水平与模型对照组比较有统计学差异（P

关键词：卵巢过度刺激综合征；血管内皮生长因子；雌二醇；白介素6

卵巢过度刺激综合征是一种在排卵诱导治疗导致的医源性并发症，在接受辅助生殖治疗时最为常见，严重的OHSS可危及生命。严重OHSS的临床特点包括卵巢肿大、腹胀、腹水、恶心、呕吐、电解质紊乱、低血容量、少尿、肾功能衰竭、胸腔积液、血液浓缩、血栓栓塞现象（脑血管疾病和心肌梗死），甚至死亡。由于辅助生殖技术的高速发展和推广，辅助生殖治疗不孕不育的需求不断增加。有报道称，OHSS所有类型的发病率从1%到高达23%的范围内是高度变化的，并且在所有治疗周期中的严重类型的发病率高达5%，特别是在发展中国家[1]。随着对OHSS研究的深入，其发病机制以及病理表现得以充分阐述，但仍然未完全清楚。本研究通过对OHSS模型大鼠造模同时给予中药干预，来观察其疗效，为临床上防治奠定基础。

1 资料与方法

1.1实验动物 选用未成年雌性Wistar大鼠（SPF级）30只，22d龄，体重平均（49.2±4.5）g，购于长沙东创实验动物科技服务部。大鼠饲养于相同环境，自由摄水饮食，室温20℃～22℃，相对湿度为40%～60%。

1.2实验分组 按体质量大小编号，根据随机数字表将30只雌性Wistar大鼠，随机共分为两组：模型中药组、模型对照组，每组15只。

1.3主要试剂与仪器 免疫组化一抗试剂，购于美国Santa Cruz公司；PV-9000试剂与DAB显色剂，购于北京中杉金桥； 白介素6检测试剂盒， 购于武汉优尔生；雌二醇放免测定盒，购于北京华英生物技术研究所。酶标仪（丹麦RAYTO公司）；722型可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；r-911全自动放免计数仪（中国科技大学实业总公司）；高倍光学显微（德国LEICA公司）。

1.4方法

1.4.1 OHSS大鼠模型建立 按改良的Ujioka方法[2]对30只未成年雌性Wistar大鼠建立OHSS模型。每只大鼠从22～25d龄连续 4d皮下注射含有10IU PMSG的生理盐水0.1ml，1次/d；26日龄（最后一次注射 PMSG后24h）皮下注射含有100IU hCG生理盐水0.1ml 1次。注射用人绒毛膜促性腺激素1000IU/支，妊娠雌马血清促性腺激素1000IU/支。

1.4.2中药及给药剂量 根据补肾健脾活血利湿法，以《华氏中藏经》中五皮饮为基础方进行加味拟方，具体中药饮片如下：陈皮、茯苓皮、生姜皮、桑白皮、大腹皮各20g、菟丝子15g、桑寄生15g、黄芪12g、白术12g、当归10、党参12g，以上药物用水浸泡30min，加热沸腾后小火微沸30min，过滤，使生药含量为1g/ml水煎剂。于造模同时，模型中药组、模型对照组分别予以加味五皮饮和生理盐水2ml灌胃进行干预，1次/d，连用7d。按动物体表面积比率换算等效剂量，公式：大鼠剂量（g）=人用剂量（g）×0.018×5。得出加味五皮饮给药剂量为：1.575g/100g/d。

1.4.3标本采集 HCG注射48h后即28d龄时，肌肉注射用苯巴比妥钠（80mg/kg） 麻醉30只OHSS模型大鼠，20min后股静脉采血2ml于试管中，待血液标本凝固后，离心（3000r/min、10min）吸取血清-20℃保存备检；沿腹部正中线切开大鼠腹腔，取出卵巢组织并称重，脱颈处死大鼠，放入装有福尔马林的PE管内固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，用于免疫组化染色。

1.4.4指标测定 血清中E2测定用放射免疫法检测，IL-6测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。卵巢中VEGF蛋白测定采用免疫组化PV二步法，应用MIQAS医学图象定量分析系统进行定量分析，每张切片在高倍镜下随机选5个有意义的视野，在同等条件下测量VEGF的阳性光密度值，取平均值为该切片的光密度值，同时测量阳性面积，并计算出阳性面积比（阳性面积/总面积），最后导入公式中计算出免疫组化阳性指数。免疫组化阳性指数=阳性面积比×平均光密度值。阳性指数越大，阳性表达越高。

1.5统计分析 采用 SPSS13.0 统计学软件对所得数据进行统计分析，计量资料采用均数土标准差（x±s）来表示；计量资料采用两独立样本的t检验，检验水准α=0.05，P

2 结果

2.1大鼠卵巢重量 肉眼观察下模型中药组、模型对照组的OHSS模型wistar大鼠双侧卵巢明显增大，呈多囊改变，可见多个卵泡。模型中药组与模型对照组比较有统计学差异（P

2.2 LI-6与E2含量 采用EILSA检测方法，于酶标仪450nm波长处读取各空OD值，计算出标准曲线为：y=27.72x2-118.57x+67.283，R2=0.9872。各组大鼠血清中IL6的含量结果，统计分析后得出，模型对照组与模型中药组比较有显著统计学差异（P

2.3大鼠卵巢VEGF检测结果 各组大鼠卵巢组织中VEGF在黄体细胞、卵泡颗粒细胞胞浆中均有表达，呈黄色，应用MIQAS医学图象定量分析系统，对两组大鼠卵巢组织图像进行分析，测量免疫组化图像中阳性区域面积比以及光密度值，计算出免疫组化阳性指数，通过统计得出结果为：模型对照组与模型中药组比有统计学差异（P

3 讨论

OHSS主要是由于卵巢在促性腺激素的刺激下，卵巢过度刺激导致血管活性物质增多，导致多个脏器功能障碍一种全身性疾病。卵巢过度刺激后所表现的主要特点为：大量的卵泡产生、血清中雌二醇的水平身高以及卵巢体积增大。导致该综合征出现的发病机制主要是，血管通透性增高，血管内液体渗出增多，血管内血液浓缩从而降低了组织器官的灌流量；同样，血液在血管内呈凝固趋势，提高了血栓形成以及血栓栓塞的概率，并且过度的渗出液将导致组织间隙的水肿，引起胸腹腔积液，甚至是肺水肿。hCG的应用不仅是诱发卵母细胞成熟关键的一步，同样也是在控制性超排卵后，诱发OHSS发生的先决条件[3]。因为使用hCG可以诱导多个卵泡和黄体的形成，颗粒细胞中的VEGF mRNA水平增高，从而产生大量的VEGF，表达在卵巢中，引起血管通透性增加[4-6]。通过与血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2），血管内皮生长因子刺激新血管的产生并且使血管通透性升高[7-9]。在OHSS的发病机制中除了由VEGF介导的卵泡血管生成和毛细血管通透性升高外，还有包括免疫系统和肾素-血管紧张素系统RAS[10，11]。

雌二醇与OHSS的发生有着密切的关系，据报道在大多数预测OHSS发生的方法中，检测血清中E2是最重要的一项指标[12]。Asch等[13]通过临床对OHSS发病率的研究中发现，如IVF-ET患者血清E2 水平在>6000IU/ L 和3500～5999IU之间时，OHSS的发生机率分别是38%、1.5%，低于3500IU/ L时，未出现1例OHSS的发生。有研究指出，在月经周期第9d时血清中E2>800pg/ml时，发生OHSS的风险将会升高[14]。Arianna等[15]研究发现在卵巢刺激的第11d，妇女血清中E2含量为3354pg/ml时，发展为OHSS的风险将高达85%。当血清中E2水平在最初的2～3中加倍升高，且高达3000pg/ml并且出现多个卵泡快速增长时，提示要进行干预，谨防发生OHSS。Navot 等[16]指出，应用HCG出现血清中E2急剧上升并且卵巢中出现30个以上的卵泡，将提示重度OHSS的发生。尽管血清中E2 过高导致OHSS发生确切机制不明确，但是与雌激素的生物学效能有一定的关系，它具有增强肝脏合成血管紧张素（AT）、扩张血管、促使水钠储留并可的作用，雌激素水平增高的同时也会引起了体内一些细胞因子的升高，因此低水平的E2 能够有效的防止OHSS的发生[17-19]。

祖国医学无OHSS的相关记载记载， 但通过临床症状如卵巢增大、胸腹腔积液、全身水肿等体征，可结合中医学中子肿、臌胀、Y瘕等范畴。根据中医理论，认为其病变涉及肺、脾、肝、肾等脏腑。五皮饮方由生姜皮、桑白皮、大腹皮、茯苓皮、广陈皮五种药物组成。方中以茯苓皮利水渗湿，兼以补脾助运化；生姜皮散水饮；桑白皮肃将肺气，以通调水道；大腹皮行水气，消胀满；陈橘皮和胃气，化湿浊五药相合，在本方基础上加以菟丝子、桑寄生、黄芪、白术、当归、党参，从而能够达共奏理气健脾，利湿消肿之效。

在研究结果中可以发现加味五皮饮能够减轻卵巢重量并且有效的抑制OHSS模型大鼠血清中E2、IL-6水平及降低VEGF蛋白在卵巢表达。通过本次研究为临床上防治OHSS奠定了理论基础。

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