重组胶原蛋白多肽在大肠杆菌中的表达优化

摘要:以Ⅵ型人胶原蛋白A2链基因为模板,PCR扩增得到目的基因CP6,构建了重组胶原蛋白表达载体,然后筛选高效表达的宿主菌,检测重组质粒的不稳定性以及对重组菌培养条件进行优化。结果表明,重组胶原蛋白在Rosetta(DE3)中表达量相对最高,重组质粒稳定性也较高。较佳的表达条件为接种量4%或5%,37 ℃、200 r/min培养至OD600 nm为0.7时,加入0.5 mol/L IPTG,培养5 h,并且纯化的重组蛋白与小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体有特异性反应。

关键词:胶原蛋白多肽;大肠杆菌(Escherichia coli);表达;优化

中图分类号:Q812文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)10-2443-05

Optimizing Expression of Recombinant Collagen Peptide in Escherichia coli

WU Ming1,2,GUO Li-quan1,CHEN Guang3

(1.Key Laboratory of Grain and Oil Processing of Jilin Province,Jilin Business and Technology College,Changchun 130062,China;2.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China;

3.School of Life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China)

Abstract:Designed primers to obtain the target gene(CP6) fragment through PCR,the template contained the protein polypeptide gene of Ⅵ type human collagen,and constructed the recombinant plasmid,and then screened the host bacteria of high efficient expression,detected the instability of recombinant plasmid,as well as optimized the culture conditions.The results showed that the best host bacterium was Rosetta(DE3) and the recombinant plasmid has higher stability. The optimal expression conditions were inoculum of 4% and 5%,37 ℃,200 r/min,cultured to OD600 nm 0.7 and added 0.5 mol/L IPTG to the culture medium,and then cultured 5 h. Western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2.

Key words:collagen peptide;Escherichia coli;expression; optimization

基金项目:2014年吉林省教育厅项目;吉林省科技厅青年基金项目(20140520145JH);吉林省2012年博士后科研项目启动项目

胶原蛋白多肽是运用链酶法水解对胶原蛋白进行提取,将其水解成可溶解性的水解胶原蛋白。胶原蛋白多肽的功能与胶原蛋白有很多不同,并涉及到生物体内多种细胞功能的活性物质[1]。目前,研究者已经发现了很多生物体的多肽,而且几乎所有生物过程都受到多肽的调节,如神经传导、细胞增殖和生长等。因此,在胶原蛋白的研究中,胶原蛋白多肽的研究已经成为一个重要领域。在胶原蛋白的众多类型中,Ⅵ型胶原蛋白(CⅥ)几乎分布在所有结缔组织中,而且它还具有维持组织完整性,能促进增殖和抗凋亡、促进细胞迁移、刺激DNA合成,具有生长因子的特性[2,3]。

目前,研究证明Ⅵ型胶原蛋白亚单位的基因突变是导致Bethlem肌病的主要原因,而且Ⅵ型胶原蛋白大量沉积能导致肝纤维化,Ⅵ型胶原蛋白还在细胞增殖和肿瘤转化方面具有一定作用。本研究构建了含有人的Ⅵ型人胶原蛋白多肽基因的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中进行表达研究,为后续研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1菌种

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由吉林农业大学生物物理实验室保存。大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)均购自宝泰克生物有限公司。

1.2试剂与质粒

ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、Axygen凝胶回收试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司;小鼠抗人COL6A2蛋白抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。pCMV-SPORT6-CoL6A2由吉林农业大学生物物理实验室自行构建;质粒pET32a购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3方法

1.3.1引物的设计根据GenBank中已报道的Col6A2序列中的开放阅读框,利用Primer5.0软件设计引物,P1为5′-ATCGAATTCGGCAACAAAGGAGC

CAAG-3′,P2为5′-ATCGTCGACGTTCTTGACAGCC

TCCTT-3′,分别含有EcoR I和Sal I酶切位点,由深圳华大基因科技有限公司合成引物。

1.3.2 重组质粒的构建与鉴定 以pCMV-SPORT6-Col6A2质粒为模板,利用合成的引物,通过PCR扩增获得目的基因CP6,PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,用Axygen凝胶回收试剂盒对目的基因片段进行回收纯化。将回收的目的基因CP6与pET32a载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,然后用质粒提取试剂盒提取质粒,用EcoR I和Sal I进行双酶切处理鉴定阳性克隆,并送深圳华大基因科技有限公司进行测序。

1.3.3高效表达宿主菌的筛选以及重组质粒不稳定性的检测将重组质粒pET32a-CP6转化大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3) 4种宿主菌中,以pET32a空载体转化的大肠杆菌作为空白对照。将阳性菌种作为出发菌,并用20%甘油保存该菌种作为第1代;7 d后,取200 μL第1代菌种接种到5 mL添加LB培养基(含100 μg/mL Amp)中培养,并用甘油保存菌种,记为第2代,依此类推,共计15代,通过不同传代次数对目的蛋白表达的影响来验证pET32a-CP6质粒的不稳定性。

1.3.4重组蛋白高效表达的培养条件从鉴定后的转化平板上挑取单菌落到5 mL LB液体培养基(含 100 μg/mL Amp),37 ℃培养至OD600 nm为0.7,然后根据不同的IPTG浓度、培养条件以及诱导时间等参数,筛选最佳的培养条件和诱导条件,以空白载体的菌株作为空白对照。

1.3.5重组蛋白的Western blotting鉴定将纯化的重组蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转印至醋酸纤维素膜上,再将膜在5%的PBS缓冲液中室温封闭2 h,洗膜后加入一抗在4 ℃放置2 h,洗膜后再加入二抗在4 ℃放置2 h,充分漂洗后加入化学发光底物Super Signal检测试剂,暗室X光片暗匣曝光、显影。一抗用的是Santa Cruz Biotechnology公司的COL6A2(1-YD19),该抗体是小鼠抗人COL6A2蛋白抗体,用于人类起源的COL6A2免疫印迹检测。

2 结果与分析

2.1目的基因的PCR扩增

以pCMV-SPORT6-CoL6A2质粒为模板,PCR扩增获得目的基因CP6,以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。由图1可以看出,目的条带大小为750 bp,与预期大小相符,并将PCR产物送深圳华大基因科技有限公司进行测序,测序结果验证正确。

2.2重组质粒pET32a-CP6的构建

将纯化的PCR扩增产物与载体pET32a连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经过菌落PCR初步筛选,获得的含有外源片段的重组质粒pET32a-CP6,用EcoR I和Sal I进行双酶切处理后可得到两段片段(图2),与预期大小一致,成功获得含有目的基因片段的重组质粒。

2.3高效表达宿主菌的筛选

取测序正确的重组质粒分别转化大肠杆菌 BL21、BL21(DE3)、 BL21(DE3)plysS、Rosetta(DE3)4种宿菌,涂布于LB(含100 μg/mL Amp)固体培养基,随机挑取单菌落过夜培养,然后进行菌落PCR验证,筛选阳性重组菌,对阳性重组菌进行诱导表达,并收集表达的蛋白后,进行SDS-PAGE电泳分析,从中筛选蛋白表达量高的重组菌株。从图3可知,4号菌株Rosetta(DE3)的重组蛋白表达量相对最高,取其作为后期研究的重组菌,进行大量培养。

2.4重组质粒不稳定性检测

大肠杆菌基因工程菌中质粒稳定性问题是基因工程菌实现规模化生产的一个重要影响因素,主要原因是含有外源基因的重组质粒转化到大肠杆菌细胞后,会产生很多生理效应,从而影响到质粒自身的稳定性。因此,外源基因的表达,不仅会导致宿主细胞自身生长速率的下降,而且会导致菌体形态的改变。这些影响主要表现为重组DNA质粒的丢失和质粒中的基因结构发生突变,能使细胞失去表达能力[5]。本试验对重组质粒pET32a-CP6的质粒不稳定性研究主要是通过不同传代次数对目的蛋白表达的影响来验证。将不同传代次数的菌种涂布于100 μg/mL Amp的LB平板,37 ℃培养1~2 h,分别挑出单菌落接种到5 mL 含100 μg/mL Amp的 LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养,培养至OD600 nm为0.7时,加入1 mol/L的IPTG诱导6 h,取样进行SDS-PAGE检测,主要检测重组蛋白的表达量。

由图4可以看出,重组菌株表达重组蛋白的效率在不同的传代次数上几乎没有差异性。随着传代次数增加,没有出现质粒分离的不稳定性现象,表明成功构建了能稳定表达蛋白的重组表达菌株。

2.5重组蛋白表达培养条件和诱导条件的优化

2.5.1 接种量对重组蛋白表达量的影响在相同的摇瓶和相同装液量的情况下,不同的接种量会对目的蛋白的表达造成影响。接种量依次按0.5%、1%、2%、3%、4%、5%和10%接入含100 μg/mL Amp的LB液体培养基。37 ℃、200 r/min振荡培养,培养至OD600 nm为0.7时,加入1 mol/L的IPTG,然后培养6 h,取样进行SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量。从图5中可以看出,在相同培养条件下,当接种量为4%和5%时,重组蛋白的表达量较高。随着接种量的增加,重组蛋白的表达量呈明显的下降趋势,当接种量达为10%时,重组蛋白表达甚微。

2.5.2IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响4%接种后,37 ℃、200 r/min振荡培养,培养至OD600 nm为0.7时,向培养基中加入终浓度分别为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的IPTG,然后培养6 h,取样进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达量。由图6可以看出,IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响不大,考虑到IPTG的毒性和成本,最终确定IPTG浓度为0.5 mol/L时效果最佳。

2.5.3IPTG添加时间对重组蛋白表达量的影响在50 mL LB液体培养基,4%接种后37 ℃、200 r/min培养,培养至OD600 nm分别为0.3、0.5、0.6、0.7、0.8时,添加0.5 mol/L IPTG进行诱导,然后培养6 h,取样进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达量。从图7分析可知,OD600 nm为0.3时重组蛋白的表达量很低,而OD600 nm为0.5、0.6、0.7、0.8时添加IPTG诱导重组蛋白表达量差异不大,最后综合考虑选择在OD600 nm为0.7时添加IPTG诱导重组蛋白表达。

2.5.4IPTG诱导时间对重组蛋白表达量的影响在LB液体培养基中,4%接种后,37 ℃、200 r/min培养,培养至OD600 nm为0.7时,向培养基中加入0.5 mol/L IPTG,然后分别培养3、4、5、6、7、8、9、10 h,取样进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达量。从图8可以看出,在加入IPTG诱导5 h时,重组蛋白的表达量最高,综合考虑,诱导5 h为最佳诱导时间。

3小结与讨论

目前,胶原蛋白的提取主要采取传统的提取方法,利用酸、碱水解法从动物的结缔组织(如猪皮、鱼皮、驴皮、牛皮等)中提取胶原蛋白,但是提取过程中会使其丧失部分的生物活性,并且提取得到的产品成分也非常复杂[5-8];其次就是利用酶解法提取胶原蛋白,这种方法具有较高的回收率,反应速度快,反应时间短,但是从动物组织提取的胶原蛋白多数不溶于水,并且也不可能在不改变分子质量的前提下重新溶解。因此,从动物组织提取的胶原蛋白可加工性弱,这就直接限制了胶原蛋白在许多方面的应用[2-6]。基因工程法生产的胶原蛋白具有安全性好、重现性好、结构稳定等优点,同时也能改善胶原蛋白的免疫排异性、亲水性等性能,从而解决了传统提取方法存在的很多缺点。

目前有关在原核细胞中表达胶原蛋白的相关研究不多,有许多问题尚待解决。首先,重组质粒上的胶原蛋白目的基因在宿主菌中是否稳定;其次,重组胶原蛋白在宿主菌中是否稳定,对宿主菌有多大的毒害作用。由于人工重组质粒往往表现出不稳定性[5],因此对重组菌,特别是用于生产的重组工程菌进行重组质粒遗传稳定性的研究是十分必要的。所谓质粒不稳定性是指工程菌在生长过程中质粒发生变化,结果不呈现原有的表型特征[5]。因为外源基因的插入势必会影响到质粒原有的复制和转录机制,一是插入的位点与质粒的稳定性有关;二是插入的外源基因一般表达真核细胞的蛋白。这样必然影响到宿主细胞本身基因的表达,改变宿主菌正常的生理状况,从而影响质粒的稳定性[5]。通过鉴定连续传代中不同代次重组菌菌落的氨苄青霉素抗性,可以获得质粒丢失菌的比例。结果表明,该重组菌在连续培养过程中未发现质粒丢失菌,工程菌株表达重组蛋白的效率在不同的传代次数上几乎没有差异性,而且随着传代次数的增加,并没有出现质粒分离的不稳定性现象。同时需要注意的是该重组菌在高密度发酵条件下的遗传稳定性需要进一步验证。

本研究利用基因工程的方法对人的Ⅵ型胶原蛋白多肽进行重组表达和纯化,并对胶原性多肽在原核细胞中的表达条件进行了初步探索。结果表明,接种量对重组蛋白的影响明显,当接种量过大时,就会直接影响菌体生长状态,影响重组蛋白的表达;溶氧量过小会导致菌体生长不足,从而影响重组蛋白的表达;IPTG的浓度对重组蛋白表达率的影响不大,综合考虑,选择接种量4%或5%,IPTG浓度为0.5 mol/L,IPTG添加时间为OD600 nm为0.7,IPTG诱导时间为5 h作为蛋白表达的较佳条件。原核表达体系与其他表达体系相比,大肠杆菌作为真核基因的表达宿主具有很多优点,如遗传背景清楚、技术操作简便、培养条件简单、大规模发酵成本低、繁殖快及生长周期短等[9-13],因此本研究选用大肠杆菌表达体系,利用基因工程法生产胶原蛋白多肽,但是目前仅是对工程菌的构建和表达做了初步的研究,后续重组蛋白的纯化和活性验证还有待深入的研究。

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