链霉菌H03发酵液中具有抗菌活性多糖的分离纯化及其单糖组成分析
时间：2022-09-07 04:04:33
摘 要：对链霉菌h03发酵产物进行了分离纯化，并对其进行了初步鉴定，对链霉菌H03发酵产物离心，采用减压蒸馏，乙醇沉淀，沉淀组分用Sevage法、盐析法去蛋白，用透析法除去小分子物质以及用Sephadex-100柱层析等技术进行纯化，纯化物质仍具有较强的抗菌活性，利用化学方法、紫外光谱、红外光谱、气质联用等方法分析该抗菌活性物质的理化性质，结果表明：从链霉菌的发酵产物中分离纯化得到的具有抗菌活性物质是多糖，这种多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3种单糖组成的，其组成比例约为2:1:1。
中图分类号：Q636.1 文献标识码：A 文章编号：1007－7847(2007)03－0212－06
链霉菌是具有复杂生活周期的革兰氏阳性放线菌(actinoraycete)，在系统生物学上归于链霉菌属(Streptomyces)，该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然产物，如抗肿瘤剂、免疫抑制剂、抗虫剂以及淀粉酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和蛋白酶等胞外水解酶，因此，近几十年来，关于链霉菌遗传、发育及代谢调控的研究倍受重视。
本实验室分离到一株链霉菌H03，该链霉菌发酵后产生一种非抗生素的大分子物质，这种大分子物质对多种植物病源真菌(如棉花枯萎病、小麦赤霉病菌、油菜菌核病、黄瓜炭蛆、甜菜褐斑、稻瘟病菌)、常见病源细菌(如大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌)具有较强的抗菌活性，为了更好地研究这种具有抗菌活性的大分子物质，本研究对这种链霉菌发酵产物中抗菌活性物质进行分离纯化，并对该物质进行了初步鉴定。
1 材料与方法
1．1 材料
链霉菌菌种由本实验室分离纯化并保存，Sephadex G-100(Phannacia公司)，标准单糖(生化试剂，亚法公司)，所有试剂均为分析纯，
种子和发酵培养基均选用液体培养基，培养基的组成为：蔗糖3％，豆饼粉3％，酵母浸膏0.2％，KH2PO40.2％，MgSO4・7H2O 0.1％，NaCl0.1％，(NH4)2SO4 0.04％，CaCO3 0.1％，初始pH7.2～7.4。
1．2 方法
1．2．1 链霉菌的发酵
将菌种接种于种子培养基中，28℃振荡培养48 h后，以8％的接种量转种至B.Braun发酵罐(BIOSTATB，GERMANY)中，在发酵温度为28℃、搅拌转速为200r/min、通气量为2.0-3.0VVM条件下培养150h，此时生物活性最强、多糖产量较高，随即放罐，以8000r/min离心(RD-20Ⅲ，TOMY SEIKO CO.，LTD TOKYO JAPAN)发酵液20min得到上清液。
1．2．2 发酵液中活性物质的分离纯化
为了获得发酵产物中具有抗菌活性的物质，将上清液进行如图1所示工艺流程处理，并采用抑菌圈试验方法检测图1工艺流程中(1)～(12)编号对应的各种物质的抗菌活性，指示菌为金黄色葡萄球菌，其中，采用Sevage法去蛋白时，向浓缩液中加入等体积的Sevage试剂(氯仿：正丁醇：5:1(V/V))，最少重复6次，而采用硫酸铵盐析法时，缓隆向浓缩液中加入固体硫酸铵，使其饱和度达到100％，为了除去小分子杂质，将上清液用截留分子质量20000Da的透析袋(ψ36，武汉亚法公司)置于双蒸水中透析48h，透析袋中截留的溶液加入2倍体积95％乙醇，充分振荡，静置过夜，次日离心，得到沉淀和上清液。
将溶液(11)、(12)分别进行冷冻干燥后，各取50mg溶于2mL 0.1mol/L NaCl溶液中，充分溶解后进行柱层析，用Sephadex G-100装柱(75cm×3cm)，流动相为0.1mol/L NaCl水溶液，流速0.3mL/min，每管收集3mL，分部收集，用硫酸-蒽酮法检测，在620nm条件下比色，并以管号为横坐标，吸光度为纵坐标绘图，收集洗脱时主峰对应的溶液，进行冷冻干燥后，取少量配成浓度为2g/L的水溶液(分别记作13、14，并进行抑菌圈试验)，剩下的样品置于干燥器中保存、备用。
1．2．3 链霉菌H03发酵产物的鉴定
1．2．3．1 化学方法鉴定
1)茚三酮反应
将2mg样品完全水解后定容至2mL，再取1mL该水解液于试管中，加茚三酮试剂1 mL，在沸水中加热20min，冷却后观察，分别取蒸馏水和小牛血清溶液(1.0g/L)1mL作为对照。
2)Molish反应
取1.0mL样品溶液(1.0g/L)于试管中，然后加2滴Molish试剂(α-萘酚)，摇匀，倾斜试管，沿管壁加入约1mL浓硫酸，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化，以蒸馏水和淀粉(1.0g/L)作为对照。
3)硫酸蒽酮反应
取2mL蒽酮溶液于试管中，加入样品溶液(1.0gV/L)0.5mL，充分混匀后观察各试管颜色变化，以蒸馏水和淀粉(1.0g/L)作为对照。
4)DNS法检测还原糖
取2mg样品于试管中，并加入3mL 2mol/L三氟乙酸，封口后置于110℃烘箱水解3h，样品完全水解后减压浓缩至于，再取2mg样品于另一只试管中，向二管中分别加入10mL双蒸水，将两者配成等体积的溶液，用DNS法测还原糖。
1．2．3．2 紫外光谱分析
将样品配制成浓度为500mg/L溶液，利用UV-240紫外扫描仪在波长400nm至190nm范围内扫描。
1．2．3．3 红外光谱分析
利用Nicolet Impact 420型红外光谱仪(KBr压片)进行样品检测。
1．2．4 多糖的单糖组成成分分析
利用GC-MS可以确定多糖的单糖组成，首先将阿拉伯糖(Ara)、木糖(xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)和半乳糖(Gal)等单糖的糖腈乙酸酯衍生物依次进样进行GC-MS分析得到各单糖的出峰时间和质谱信号，然后将样品水解后的衍生物进样进行GC-MS分析，根据出峰时间和质谱信号可以确定样品的单糖组成成分，而且根据出峰面积可以确定单糖的组成比例。
检测仪器及条件：FINIGAN TRACE气相色谱仪、质谱仪，DB-FFAP毛细管柱(30cm×0.25mm×0.25μm)；程序升温：80～140℃，30℃/min；保留2min；140-250℃，10℃/min保留7min。
样品酸水解：精密称取样品10mg，加入3mL2mol/L三氟乙酸，封口后置于在110℃烘箱
水解2h，真空干燥除去三氟乙酸。
糖腈乙酸酯衍生物的制备：向除去三氟乙酸的水解物中分别加入10mg盐酸羟胺，0.6mL吡啶，密封后于90℃水浴振荡反应30min，取出冷却至室温，再加入0.9mL乙酸酐反应40min，反应产物直接进行GC-MS分析，另取各标准单糖10mg，按上述条件衍生化后进行GC-MS分析，以确定各单糖衍生物在GC-MS分析时的出峰时间和质谱信号，然后比较各单糖衍生物和样品水解物在相同条件下的保留时间和质谱信号就可确定多糖样品的单糖组成。
2 结果与分析
2．1 发酵产物分离过程中抗菌活性试验结果(表1)
活性试验表明，链霉菌发酵液(1)具有抗菌活性，经浓缩后的发酵液(2)抗菌活性更强，用savage法和盐析法得到的沉淀部分即蛋白质(4和5)都没有抗菌活性；而上清液(3和6)仍有抗菌活性；上清液经过ψ36透析袋透析去掉小分子物质后，透析袋内的物质(7和8)具有抗菌活性，当透析袋内的物质用乙醇沉淀后其上清液(9和10)没有抗菌活性而沉淀部分(11和12)具有抗菌活性，最后将沉淀部分用Sephadex G-100进行柱层析处理，主峰对应溶液仍然具有非常强的抗菌活性(13和14)；而且抑菌活性随着产物的纯度的增加而增强；随着产物的浓度的增加而增强。
从上述分离纯化试验和抗菌试验中可以看出，最后得到的具有抑菌活性的物质是一种非蛋白质类的大分子物质，由于ψ36透析袋能透过的物质的最大分子质量为20000Da，所以透析袋内截留下来的物质分子质量大于20000Da，此外，根据所采用的分离纯化方法，可以推断该大分子物质可能是糖类物质，但该大分子物质的具体杀菌机理和准确的分子质量大小有待于进一步的试验说明。
2．2 H03发酵产物的初步鉴定
2．2．1 颜色反应的结果
茚三酮反应的结果显示，蒸馏水、样品对应试管无色，而小牛血清对应的试管变成蓝紫色，由于小牛血清中的蛋白质水解后，氨基酸与茚三酮发生反应生成蓝紫色物质，故反应呈阳性，而蒸馏水和样品与茚三酮反应均呈阴性，说明样品中不含有蛋白质。
Molish反应的结果显示，在含有样品的试管和以淀粉作为对照的试管中，两层液面交界处出现紫红色环，而以蒸馏水作为对照的试管中没有任何颜色变化，由于糖类物质在浓硫酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物，后者与α－萘酚作用形成紫红色复合物，因而在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，样品溶液和淀粉溶液都是Molish阳性反应，说明待测样品溶液中有糖类物质存在。
硫酸－蒽酮反应的结果显示，在含有样品的试管和以淀粉作为对照的试管中，溶液变成蓝绿色，而以蒸馏水作为对照的试管中没有任何颜色变化，由于糖类物质在浓硫酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物，后者与蒽酮作用生成蓝绿色复合物，样品溶液和淀粉溶液都是硫酸－蒽酮阳性反应，说明待测样品溶液中有糖类物质存在，
在波长540nm下比色发现，未水解的样品OD是0.028，经过水解的样品OD是0.376，水解后OD约为水解之前的13.4倍，由于3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后在碱性条件下生成棕红色化合物，在一定范围内还原糖含量与反应液颜色成正比，因而用比色法测得的OD可反应还原糖含量，从试验结果可以看出，样品水解之前DNS反应的OD非常小，说明样品几乎不含有还原糖，而在样品经酸水解之后，DNS反应的OD比较大，说明样品水解后的溶液中含有较多的还原糖，可以推测样品经水解后释放出了还原糖。
2．2．2 紫外光谱分析
样品在波长400～190nm范围内进行紫外光谱扫描结果如图2所示。
一般认为，在紫外光谱的吸收中，蛋白质在280nm左右具有特征吸收峰，核酸260nm左右具有吸收峰，而多糖在195nm处左右有特征吸收峰，从图2可以看出，样品在波长400mn至190 nm范围内进行紫外光谱扫描后，在195nm。左右有多糖特征吸收峰，未发现有蛋白质(280nm左右)和核酸(260nm左右)及其它杂质特征吸收峰，紫外扫描的结果表明，该样品是一种不含有蛋白质和核酸的大分子多糖。
2．2．3 红外光谱分析
红外光谱广泛应用于有机化学、高分子化学以及药物化学分析，近年来人们对多糖的红外光谱进行广泛的研究，利用Nicolet Impact 420型红外光谱仪进行样品扫描的图谱如图3所示：红外光谱结果表明，样品在4000cm-1～700cm-1主要特征吸收峰有3409、2932、1660、1402、1185、1113、879、814cm-1，其中3600cm-1～3200cm-1和1665cm-1～1635cm-1的两组峰，表明为糖类化合物3400cm-1的强吸收峰为糖分子中羟基的伸缩振动吸收峰，2930cm-1附近的吸收峰是C-H的伸缩振动峰，1660cm-1附近强吸收峰是C=0的伸缩振动，1185cm-1附近的吸收峰证明其中的单糖以吡喃糖苷的形式存在，1113cm-1附近的吸收峰是由糖环的C-O-C伸缩振动所产生，870cm-1、810cm-1附近有吸收峰，说明样品中可能有甘露糖，840cm-1处无吸收，说明不含α-糖苷键，而含β-糖苷键，红外光谱在1700cm-1～1775cm-1处无吸收，表明多糖不含有葡萄糖醛酸。
通过颜色反应试验可以确定样品是一类多糖类物质，紫外光谱分析表明样品中不含有蛋白质、核酸等杂质，红外光谱分析进一步证明样品是多糖类的物质，综上所述，从链霉菌发酵液中分离纯化的产物是具有杀菌活性的大分子多糖。
2．3 多糖的单糖组成成分分析
标准单糖和样品水解物衍生物的气相色谱分析的保留时间如图4所示，各峰对应物质的质谱信号如表2和表3所示。
比较各标准单糖出峰时间和质谱信号，可以看出阿拉伯糖(Ara)衍生物、木糖(xyl)衍生物、甘露糖(Man)衍生物、葡萄糖(Glu)衍生物和半乳糖(Gal)衍生物的出峰时间分别是14.23、15.79、18.42、18.97和19.83min(图4 a)；质谱信号(m/z)分别是256、256、315、315、315(表2)，样品衍生物气相色谱图中3个峰对应出峰时间分别是18.40、18.95和19.82min(图4 b)，质谱信号分别是315、315、315(表3)，由此可以看出，样品水解物的3个峰对应的分别是甘露糖、葡萄糖和半乳糖，用积分的方法(即面积归一法)计算样品气相色谱图中各峰的面积所占的比例分别51.76％、24.08％和24.16％，由此可以得出甘露糖、葡萄糖和半乳糖这3种单糖的组成比例约为2:1:1。
3 讨论
多糖作为三大类生物大分子物质之一，较早为人们所认识，但是对多糖的研究却远远落后于对蛋白质和核酸的研究，其主要原因在于多糖复杂的结构难以研究，随着对多糖的认识不断深入，发现多糖具有各种各样的生物功能，如多糖的糖链能控制细胞的分裂与分化，调节细胞的生长与衰老，能增强机体的免疫功能等，20世纪70年代，对多糖生物活性的研究领域日趋广泛，相继发现糖类物质具有抗炎、抗病毒、抗辐射、降血脂、抗水肿等多种生物活性，如wang和Luo从绞股蓝提取了一种抗氧化活性的水溶性多糖；赵国华等报道了百合多糖具有抗肿瘤活性；芮雯等从带形蜈蚣藻中提取一种硫酸多糖并研究了其抗病毒活性，这些具有生物活性的多糖绝大部分是从植物中提取，而具有生物活性的微生物多糖报道较少，特别是具有抗菌活性的微生物多糖几乎未见报道。
链霉菌属是放线菌中最大的一个属，种类繁多，而且有一半以上能产生重要的抗生素，如链霉素、金霉素、四环素、土霉素、氯霉素、红霉素、螺旋霉素、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素和丝裂霉素等，所以，人们的注意力主要集中在链霉菌生产抗生素的研究上，本实验室分离到的链霉菌H03，经过发酵后能产生一种大分子多糖，该多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖3种单糖组成的，其组成比例约为2:1:1，这种多糖具有较强的抗菌活性，可以将其开发成生物防腐剂或抗感染药物，关于这种多糖的分子质量的测定、各单糖的连接方式、抗菌机理等其他生理活性研究与应用，将在其他文章中继续报道。
作者简介：何峰(1974－)，男，湖北黄冈人，博士研究生，主要从事微生物发酵及生物技术方面研究；余龙江(1966－)，男，湖北黄冈人，华中科技大学教授，博士，通讯作者，主要从事资源生物学与生物技术方面研究。
